单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103031324A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN103031324A(43)申请公布日2013.04.10(21)申请号201210554934.0(22)申请日2012.12.05(71)申请人内蒙古大学地址010021内蒙古自治区呼和浩特市大学西路235号(72)发明人李光鹏胡晓明杨磊谌颜于超然扈廷茂(51)Int.Cl.C12N15/63(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书55页页序列表序列表22页页附图附图22页页(54)发明名称单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法，其含有独立基因转移体MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR，其中MAR为牛核基质结合区；CAG为启动子；FAT1为n-3去饱和酶基因；polyA为终止区。本发明的单顺反子独立基因转移体无主干载体序列和任何选择标记，避免了它们对转基因动物以及人类带来的潜在危害，是具转基因安全性的独立基因转移体。CN10324ACN103031324A权利要求书1/1页1.单顺反子基因表达试剂盒，其含有独立基因转移体MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR，其中MAR为牛核基质结合区；CAG为启动子；FAT1为n-3去饱和酶基因；polyA为终止区；所述的独立基因转移体无主干载体序列和任何选择标记。2.根据权利要求1所述的单顺反子基因表达试剂盒，所述独立基因转移体的全序列为SEQNO.：1。3.权利要求1或2所述的单顺反子基因表达试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：利用图1所示的质粒载体pMAR-CAG-FSTN-IRES-AcGFP1-polyA-MAR作为初始载体构建没有主干载体序列、没有抗性基因、没有荧光标记的安全载体，先用EcoRI和NotI对质粒载体进行双酶切，将FSTN、IRES、AcGFP1切掉，再插入一段中间序列T，通过此序列引入新的酶切位点，再通过新的酶切位点插入FAT1序列。4.根据权利要求3所述的制备方法，所述的新的酶切位点是HindIII酶切位点。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的FAT1序列通过如下引物进行PCR获得：FAF3正义链：5′AATCGaagcttCTGGTTATTGTGCTGTCTCAT3′FAR4反义链：5′AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG3′。6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于插入FAT1序列通过SacI、Af1II双酶切获得MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR单顺反子基因表达盒。2CN103031324A说明书1/5页单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域中的基因工程技术，具体涉及一种单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法。背景技术[0002]在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。影响外源基因高效表达的因素很多，如启动子、甲基化、基因本身结构、插入位点、调控序列(增强子、绝缘子、核基质结合区)等。[0003]CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(thecytomegalovirus，CMV)早期增强子(earlyenhancerelement)和鸡β-肌动蛋白(chickenbeta-actin)启动子组成，CAG启动子是非特异性的组成型启动子，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。本研究所用初始载体pCAG-IRES2-AcGFP1，是本研究室由pCAGEN载体上的CAG启动子移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1中的CMV，同时以pCAGEN载体上RabbitglobinpolyA移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1中的SV40polyA而得到的。[0004]核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。[0005]我们从牛基因组克隆获得的MARs序列大小为1203bp，AT含量为62.31％，经生物信息学分析发现该序列也含有一个典型的DNA解旋序列(aatatt).一个潜在的T-box(taatcaa)和一个潜在的TATA-box(tataat)序列结构。[0006]研究表明，MARs序列的功能包括边界因子(boundaryelement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARs对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。[0007]基因表达盒研