双顺反子共表达基因转移体及制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102994536A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102994536A(43)申请公布日2013.03.27(21)申请号201310005542.3(22)申请日2013.01.08(71)申请人内蒙古大学地址010021内蒙古自治区呼和浩特市玉泉区昭君路24号内大南校区动物中心(72)发明人李光鹏胡晓明于超然杨磊谌颜扈廷茂(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人韩奎勇(51)Int.Cl.C12N15/63(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书1212页页序列表序列表1111页页附图附图44页页(54)发明名称双顺反子共表达基因转移体及制备方法(57)摘要本发明涉及一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法，基因转移体的基因序列为：SEQIDNo.15，该基因转移体的5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、RabbitglobinpolyA信号区；该制备方法包括：构建载体pCAG-IRES2-AcGFP1；FSTN基因的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；MAR序列的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；质粒载体构建及获得双顺反子共表达基因转移体。本发明的基因转移体不仅是洁净的、安全的基因转移体，而且实现了任意组合的双基因共表达，通过IRES的重复利用，实现多基因共表达的目的，为改善双、多基因控制的形状如经济性状提供新的思路和途径。CN10294536ACN102994536A权利要求书1/2页1.一种双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：基因转移体的基因序列为：SEQIDNo.15。2.根据权利要求1所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述基因转移体从5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、RabbitglobinpolyA信号区。3.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得：CAG前的MAR序列：CMAF1正义链，5＇到3＇：SEQIDNo.9；CMAR2反义链，5＇到3＇：SEQIDNo.10；PolyA后的MAR序列：PMF1正义链，5＇到3＇：SEQIDNo.11；PMR2反义链，5＇到3＇：SEQIDNo.12。4.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述核基质结合区MAR的序列为：SEQIDNo.13。5.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述抑制蛋白基因FSTN的序列通过如下引物进行PCR获得：FMF1正义链，5＇到3＇：SEQIDNo.7；FMR2反义链，5＇到3＇：SEQIDNo.8。6.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述抑制蛋白基因FSTN的序列为：SEQIDNo.14。7.一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，步骤如下：第一步，由pCAGEN载体上的CAG启动子移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1，中的CMV，同时以pCAGEN载体上RabbitglobinpolyA移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1中的SV40polyA，构建载体pCAG-IRES2-AcGFP1；第二步，FSTN外源基因的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；第三步，MAR序列的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；第四步，质粒载体pMAR-CAG-FSTN-IRES-AcGFP1-polyA-MAR构建完毕后，用SacⅠ、AflⅡ双酶切，获得MAR-CAG-FSTN-IRES-AcGFP1-polyA-MAR双顺反子共表达基因转移体。8.根据权利要求7所述的双顺反子共表达基因转移体的制备方法，其特征在于：所述步骤第一步，进一步的具体步骤包括：⑴插入T片段，改变酶切位点：从PMD19T-simplevector上获得T片段，通过酶切位点将该片段连入载体，改变载体上原有酶切位点的顺序；⑵CAG启动子的插入：将CAG启动子从pCAGEN载体上切下，连入到上述载体中；⑶RabbitglobinpolyA的获得和插入：从pCAGEN载体上获得RabbitglobinpolyA序列，通过两个酶切位点将获得的RabbitglobinpolyA序列插入到载体pIRES2-AcGFP1中；⑷CMV启动子的切除：将CMV启动子从载体pIRES2-AcGFP1