用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN103214560103214560B(45)授权公告日2014.10.01(21)申请号201310097943.6A61K39/135(2006.01)(22)申请日2013.03.25A61P31/14(2006.01)审查员王奇(73)专利权人中国牧工商（集团）总公司地址100070北京市丰台区南四环西路188号11区20号楼专利权人中牧实业股份有限公司(72)发明人肖进齐鹏巴利民栗利芳宋芳董春娜王楠张蕾周强郭丽清郑应华(74)专利代理机构北京瑞恒信达知识产权代理事务所(普通合伙)11382代理人李渤张伟(51)Int.Cl.C07K14/09(2006.01)C07K7/08(2006.01)C07K1/06(2006.01)C07K1/04(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书8页说明书8页序列表4页序列表4页(54)发明名称用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途(57)摘要本发明提供一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列以及含有该多肽的肽疫苗。提供的牛口蹄疫O型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题，因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。CN103214560BCN1032456BCN103214560B权利要求书1/2页1.一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示；并且，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键，且所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。2.根据权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；(2)合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；(3)使用乙醚沉淀所述多肽；和(4)对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：(1-a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；(1-b)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑、二环己基碳二亚胺与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；(1-d)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；和(1-e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H2O。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的裂解时间为1-4小时。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤(3)中还包括：(3-a)使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；(3-b)在加入占反应体系总体积10％的二甲基亚砜情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；和(3-c)使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在加入占反应体系总体积1％的二异丙基碳二亚胺和0.5％的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在加入0.1MH2SO4情况下使羧基与羟基之间反应形成共价连接。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)包括以下步骤：(4-a)使用切向过滤膜包在20-28℃条件下超滤所述多肽，从而除去小分子杂质；和(4-b)使用0.2微米在线滤器除菌保存。9.一种牛口蹄疫O型肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗包含根据权利要求1所述的多肽。2CN103214560B权利要求书2/2页10.根据权利要求9所述的肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗还包含佐剂。11.根据权利要求10所述的肽疫苗，其特征在于，所述佐剂为选自白油、50V、50VII中的