一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103966285103966285A(43)申请公布日2014.08.06(21)申请号201310034685.7C07K1/30(2006.01)(22)申请日2013.01.30A61K38/02(2006.01)A61P35/00(2006.01)(83)生物保藏信息C12R1/12(2006.01)CGMCCNo.70782012.12.31(71)申请人大连海洋大学地址116000辽宁省大连市西岗区黄河路219号申请人张付云(72)发明人张付云徐凤苍桂璐杨阳刘晔(74)专利代理机构大连非凡专利事务所21220代理人曲宝威(51)Int.Cl.C12P21/00(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书2页说明书2页(54)发明名称一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用(57)摘要一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤为：取海胆卵研磨，将研磨液涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养2天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2；将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃发酵1天，牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6%；4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，10000r/min离心处理30min，将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。本方法操作简单、成本低廉。CN103966285ACN10396285ACN103966285A权利要求书1/1页1.一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：a.取健康、新鲜的海胆卵研磨成均浆后，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃恒温条件下培养2天；b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2（Bacilluspolymyxa）；该菌株已于2013年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCCNo:7078；c.将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃条件下发酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6%；d．在4000r/min的条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，在10000r/min条件下离心处理30min，将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。2.一种根据权利要求1所述所的海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的应用。2CN103966285A说明书1/2页一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及医药领域，特别是一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法。背景技术[0002]海胆为棘皮动物门(Echinoderma-to)海胆纲(Echinoidea)动物。海胆以其生殖腺供食，其生殖腺又称海胆卵、海胆籽、海胆黄、海胆膏，色橙黄，味鲜香，占海胆全重的8%～15%。目前世界上已发现的海胆有850余种，常见的包括光棘球海胆（也称大连紫海胆）、紫海胆以及马粪海胆。[0003]海胆纲的一些种类自古即为滋补佳品，常用于预防和治疗一些疾病，这些功能主要是由其所含多糖、蛋白、脂肪酸、色素、微量元素等活性物质成分决定的，各成分的鉴定及功效正在被逐渐证明。另外海胆中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、利用海胆卵制备海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的方法，克服现有技术的不足。[0005]本发明的一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤如下：a.取健康、新鲜的海胆卵研磨后，将200µL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃恒温条件下培养2天；b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2（Bacilluspolymyxa）；该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCCNo:7078；c.将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃条件下发酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6%；d．在4000r/min的条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，