一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103966287103966287A(43)申请公布日2014.08.06(21)申请号201310034692.7C07K1/34(2006.01)(22)申请日2013.01.30C07K1/30(2006.01)A61K38/16(2006.01)(83)生物保藏信息A61P35/00(2006.01)CGMCCNo.70772012.12.31A61P35/02(2006.01)(71)申请人大连海洋大学C12R1/10(2006.01)地址116000辽宁省大连市西岗区黄河路219号申请人张付云(72)发明人张付云徐凤杨阳苍桂璐王维才(74)专利代理机构大连非凡专利事务所21220代理人曲宝威(51)Int.Cl.C12P21/00(2006.01)C07K1/36(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书3页说明书3页(54)发明名称一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法及其应用(57)摘要一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，取干净、新鲜的海带并灭菌处理；对海带进行研磨，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃的条件下恒温培养5~7天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，得到海带内生地衣芽孢杆菌DNN6；以抑菌活性为指标优化菌株培养条件，优化的培养条件为菌株DNN6在pH9，蔗糖50g/L和蛋白胨10g/L的培养基中25℃发酵6天。8000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4℃静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白。本方法操作简单、成本低廉。CN103966287ACN10396287ACN103966287A权利要求书1/1页1.一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：a、取干净、新鲜的海带并灭菌处理，所述的灭菌处理是用75%的酒精和1%的氯化汞对海带的表面进行灭菌处理；灭菌处理后对海带进行研磨，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃的条件下恒温培养5~7天；b、挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，得到地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）,保藏号为CGMCCNo.7077；c、以抑菌活性为指标优化菌株培养条件，优化的培养条件为菌株DNN6在pH9，蔗糖50g/L和蛋白胨10g/L的培养基中25℃发酵6天；d、8000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4℃静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得到海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白。2.根据权利要求1所述的海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白在抗肿瘤方面的应用。2CN103966287A说明书1/3页一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及医药领域中抗肿瘤蛋白的一种制备方法，特别是一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法。背景技术[0002]海带(LaminariaJaponicaAresch)是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。它生长于水温较低的海中，分布于中国北部沿海及朝鲜、日本和苏联太平洋地区沿岸，在中国北部及东南沿海有大量养殖。海带主要是自然生长，也有人工养殖，多以干制品行销于市，质量以色褐、体短、质细而肥厚者为佳。海带有“长寿菜”、“海上之蔬”“含碘冠军”的美誉。[0003]海带作为一种重要的海洋资源，其食用与药用价值早为世人所知。从海带中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗HIV和增强免疫功能,对治疗心脑血管疾病和中、早期慢性肾衰等均有一定的作用。海带中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有在抗肿瘤方面被充分利用。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉的海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，使海带在抗肿瘤方面得以广泛应用。[0005]本发明的一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，步骤如下：a、取干净、新鲜的海带并灭菌处理，所述的灭菌处理是用75%的酒精和1%的氯化汞对海带的表面进行灭菌处理；灭菌处理后对海带进行研磨，研磨成匀浆，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃的条件下恒温培养5~7天；b、挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis；该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普