一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105518124A(43)申请公布日2016.04.20(21)申请号201580000472.X(22)申请日2015.06.26(85)PCT国际申请进入国家阶段日2015.09.29(86)PCT国际申请的申请数据PCT/CN2015/0824852015.06.26(71)申请人深圳市第二人民医院地址518037广东省深圳市福田区笋岗西路3002号(72)发明人蔡志明牟丽莎冯万有(74)专利代理机构深圳鼎合诚知识产权代理有限公司44281代理人孙银行彭愿洁(51)Int.Cl.C12N5/075(2010.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法(57)摘要本发明公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法，该培养液包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。本发明的猪卵母细胞体外成熟培养液能够显著地提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。实验证实，本发明的培养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳定在80%，孤雌胚胎发育率可达85%，整个成熟培养过程中无需更换培养液，操作简单。CN105518124ACN105518124A权利要求书1/1页1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，按体积百分含量计，含有10%的猪卵泡液和10%的胎牛血清，并含有10-15IU/mL的eCG、10-15IU/ml的hCG、低于100ng/mL的EGF和低于40ng/mL的IGF-1。3.根据权利要求1或2所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，还包括谷氨酰胺和庆大霉素。4.根据权利要求3所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括如下组分：谷氨酰胺0.05-0.20mg/mL；庆大霉素0.02-0.10mg/mL；猪卵泡液10%（v/v）；胎牛血清10%（v/v）；eCG10-15IU/mL；hCG10-15IU/ml；EGF50ng/mL；IGF-110ng/mL；TCM-199余量。5.一种制备权利要求1-4任一项所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的方法，其特征在于，所述方法将猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1添加到TCM-199基础培养基中，任选地，加入谷氨酰胺和庆大霉素，制得所述培养液。6.根据权利要求5所述的制备猪卵母细胞体外成熟培养液的方法，其特征在于，所述培养液包括如下组分：谷氨酰胺0.05-0.20mg/mL；庆大霉素0.02-0.10mg/mL；猪卵泡液10%（v/v）；胎牛血清10%（v/v）；eCG10-15IU/mL；hCG10-15IU/ml；EGF50ng/mL；IGF-110ng/mL；TCM-199余量。7.一种猪卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，所述方法包括将猪卵母细胞置于权利要求1-4任一项所述的培养液中培养。8.根据权利要求7所述的猪卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，所述培养液置于5%CO2饱和湿度的培养箱至少平衡6小时再用于培养所述猪卵母细胞。9.根据权利要求7所述的猪卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，所述猪卵母细胞从4-7mm的卵泡挑取。10.根据权利要求7所述的猪卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，所述猪卵母细胞在38.5℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养42-44小时。2CN105518124A说明书1/6页一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法技术领域[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法，以及使用该培养液培养猪卵母细胞的方法。背景技术[0002]卵母细胞体外培养成熟是胚胎生物技术的基础和关键环节。目前，胚胎技术已极大地推畜牧业和医学的进程，如品种改良、转基因抗病品种培育、人类疾病模型的制备、动物生物反应器药用蛋白的生产及发育机理的探究等。[0003]猪的体细胞克隆及疾病模型制备等都需要大量具有发育潜能的卵母细胞，但目前的猪卵母细胞体外成熟率不够理想。[0004]目前，猪的卵母细胞培养有以下几种体外培养基础液，如北卡罗来纳州立大学研制的培养液(NorthCarolinaStateUniversity(NCSU23/NCSU37)、PZM系列(PZM-3/PZM-4/PZM-5)培养液和TCM-199。其中TCM-199是公认的最成功的培养基础液，基本能满足猪卵母细胞体外发育代谢和营养需要。然而这些经体外培养猪卵母细胞表明，