一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115354019A(43)申请公布日2022.11.18(21)申请号202211153645.X(22)申请日2022.09.21(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人苗义良周吉隆范振港何海楠刘鑫张霞(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465专利代理师田立媛(51)Int.Cl.C12N5/075(2010.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用(57)摘要本发明公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用，属于家畜繁殖技术领域。本发明公开的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。本发明可有效获得大量高质量卵母细胞，为体外受精、孤雌激活、核移植制备克隆胚胎等技术提供支持，并在良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等方面发挥重要意义。CN115354019ACN115354019A权利要求书1/1页1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。2.根据权利要求1所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.048mg/mL或0.144mg/mL的柠檬酸。3.根据权利要求1或2所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述基础培养液以不含HEPES的M199培养液为基础，添加90％体积分数TCM199、10％体积分数猪卵泡液，同时补充添加1mg/mL的L‑半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素。4.权利要求1或2所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液在提高猪卵母细胞体外成熟率及发育质量中的应用。2CN115354019A说明书1/6页一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用技术领域[0001]本发明涉及家畜繁殖技术领域，更具体的说是涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。背景技术[0002]猪卵母细胞体外成熟培养是家畜繁殖技术中的重要环节。成熟卵母细胞广泛应用于体外受精、孤雌激活、核移植制备克隆胚胎等技术领域，进一步可为良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等提供支持。但目前猪卵母细胞体外成熟过程中存在成熟率、发育质量不一致等问题，制约了后续的基础研究及生产实际使用，因此提高猪卵母细胞体外成熟刻不容缓。导致卵母细胞体外成熟效率低的原因在于与体内成熟相比，母体内环境的不同及众多其他影响因素，体外成熟培养体系无法完全还原体内微环境，因此急需建立一种更稳定，卵母细胞成熟效率更高的体外培养体系。[0003]目前，体外成熟过程中添加何种有益于卵母细胞发育的核心因子尚不明确，普遍认为有助于卵母细胞成熟的因子包括激素、生长因子、细胞因子和其他组分等。[0004]因此，提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0005]有鉴于此，本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007]一种猪卵母细胞体外成熟培养液，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。[0008]进一步，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.048mg/mL或0.144mg/mL的柠檬酸。[0009]进一步，所述基础培养液以不含HEPES的M199培养液为基础，添加90％体积分数TCM199、10％体积分数猪卵泡液，同时补充添加1mg/mL的L‑半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素。[0010]进一步，所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液在提高猪卵母细胞体外成熟率及发育质量中的应用。[0011]课题组前期通过代谢组筛选得出体内卵泡液中柠檬酸水平与卵母细胞发育潜力呈正相关，同时也证实了柠檬酸作为三羧酸循环中起始能量底物，有助于卵母细胞的成熟发育过程。三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，调控生物体代谢生长发育，柠檬酸通过增强三羧酸循环代谢途径，提高ATP水平，促进Ca2+振荡，有助于提高卵母细胞活化，进而提高卵母细胞体外成熟，在卵母细胞活化及后续胚胎发育中起到不可替代的作用。[0012]柠檬酸在猪卵母细胞基础培养液中的应用，具体为柠檬