一种载抗菌肽基因的药物递送系统及构建和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106333936A(43)申请公布日2017.01.18(21)申请号201610715246.6C12N15/85(2006.01)(22)申请日2016.08.23(71)申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人谭勋樊国娟章乔艳(74)专利代理机构杭州千克知识产权代理有限公司33246代理人黎双华(51)Int.Cl.A61K9/51(2006.01)A61K47/36(2006.01)A61K38/17(2006.01)A61P15/14(2006.01)A61P31/04(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种载抗菌肽基因的药物递送系统及构建和应用(57)摘要本发明的目的在于提供一种以牛抗菌肽BMAP28为治疗基因的药物递送系统、包括基因表达载体、药物递送载体及其制备方法与应用。它是利用分子克隆技术，包括PCR技术、点突变技术和酶切插入连接等，构建携带有BMAP28基因的分泌型真核表达质粒。将裸质粒DNA用壳聚糖纳米粒包封，制备成载抗菌肽基因的壳聚糖纳米递送系统。本发明的药物递送系统可有效介导基因药物在真核细胞中表达并分泌到胞外，对奶牛乳腺炎具有较好的疗效。CN106333936ACN106333936A权利要求书1/1页1.一种载抗菌肽基因的药物递送系统，其特征在于，所述载抗菌肽基因的药物递送系统由以下步骤制得：(1)pEGFP-C3-SP质粒的构建：设计引物构建携带有BMAP28信号肽序列的质粒，将信号肽序列插入pEGFP-C3质粒的EGFP编码基因的起始密码子之后，上游引物为：5’-GGCGCTGGCCGAGGGCAGCGCTAGTCCCAGCAGCAGTAGCCAAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCAC-3’，下游引物为：5’-GAGACCCAGAGGGCCAGCCTCTCCCTGGGACGGTGGTCACTGGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTC-3’；以pEGFP-C3质粒为模板，用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增；扩增产物用BluntingKinationLigationKit进行平滑末端连接，将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性菌落测序，以确定SP序列正确插入，测序正确的质粒命名为pEGFP-C3-SP；(2)pEGFP-C3-SP-BMAP28载体的构建：以牛中性粒细胞cDNA为模板，PCR扩增BMAP28(序列号：NM_174832)全长编码区序列，并添加EcoRI和XbaI酶切位点，正向引物为5’-CGGAATTCATGGAGACCCAGAGGGCCAG-3’，下划线为EcoRI酶切位点；反向引物为5’-GCTCTAGATTACCCCAAATGGAGTAG-3’，下划线为XbaI酶切位点；割胶回收BMAP28片段，与质粒pEGFP-C3-SP分别进行EcoRI和XbaI双酶切后，使用T4DNA连接酶将BMAP28片段定向插入pEGFP-C3-SP的EcoRI/XbaI位点；重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，阳性克隆进行EcoRI/XbaI双酶切鉴定，并测序，将测序和双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pBMAP28；(3)壳聚糖-质粒DNA纳米粒的制备：配置0.02％质量体积浓度的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节pH值至5.5；配制5mMNa2SO4溶液，将pBMAP28质粒用Na2SO4溶液分别稀释成浓度为75～200μg/mL的溶液，将壳聚糖溶液和质粒DNA溶液分别置于55℃水浴中加热10min，取等体积壳聚糖溶液和质粒DNA溶液迅速混合，涡旋震荡30s，室温静置30min，制备得到壳聚糖/质粒DNA复合物，即载抗菌肽基因的药物递送系统。2.如权利要求1所述的载抗菌肽基因的药物递送系统，其特征在于，步骤(1)中PCR反应条件为：94℃30s，62℃30s，72℃5min，35个循环。3.如权利要求2所述的载抗菌肽基因的药物递送系统，其特征在于，步骤(3)中将pBMAP28质粒用Na2SO4溶液稀释成浓度为175μg/mL的溶液。4.权利要求1-3任一所述载抗菌肽基因的药物递送系统在制备奶牛乳腺炎药物中的应用。2CN106333936A说明书1/6页一种载抗菌肽基因的药物递送系统及构建和应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程制药领域，具体涉及一种抗菌肽基因融合表达质粒的构建和载基因递送系统的制备。背景技术[0002]奶牛乳腺炎(mastitis)是严重危害成乳奶牛的一种乳腺疾病，可由多种病原微生物感染引起。长期以来，抗生素作为治疗奶牛乳腺炎的常规药物被广泛使用，导致耐药菌株不断出现，传