一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109022350A(43)申请公布日2018.12.18(21)申请号201810952148.3(22)申请日2018.08.21(71)申请人华中科技大学同济医学院附属同济医院地址430030湖北省武汉市解放大道1095号(72)发明人曾锐徐虎子邓旋赵志(74)专利代理机构北京一格知识产权代理事务所(普通合伙)11316代理人赵永伟(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书3页附图2页(54)发明名称一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基(57)摘要本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500mLDMEM/Ham´sF12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。CN109022350ACN109022350A权利要求书1/1页1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500mLDMEM/Ham´sF12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。2.根据权利要求1所述的一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E21mL、Trijod-Thyronine5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。3.一种提取小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于75%酒精中浸泡10min，然后在细胞台中将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于PBS中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剁碎；（2）在细胞培养箱中将剪碎的肾组织使用0.2%的胶原酶IV消化1h，每15min吹打一次使其消化更均匀，随后，先后使用70um和40um的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液；（3）将悬液进行1200rpm*8min离心处理，然后加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min，然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用；（4）将经红细胞裂解处理后的样品进行1200rpm*8min离心处理，然后再加入PBS进行洗涤；（5）将加入PBS洗涤的样品进行1200rpm*8min离心，然后加入10mL权利要求1或2所述的培养基进行重悬；（6）将重悬液加入1029Corning培养皿中放于细胞培养箱贴壁1h使巨噬细胞贴壁去除；（7）将1029培养皿中的培养基轻轻吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得到纯化的原代肾小管上皮细胞。2CN109022350A说明书1/3页一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基技术领域[0001]本发明涉及原代肾小管上皮细胞的提取及培养领域，具体涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基。背景技术[0002]传统的肾小管上皮细胞系虽然构建简单，使用较普遍，但是这些细胞系丧失部分功能，只能部分表达某几种转运和代谢相关酶，且从体内分离的时间相对较长，因此不足以模仿体内的真实情况，得到的研究结果参考性差。此外，传统的原代肾小管上皮细胞提取技术得到的肾小管上皮细胞系中掺杂有较多其他细胞，纯度仅60%左右，用于研究时难免受其他杂质细胞的影响。发明内容[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，旨在提供一种功能上与其在体内的情况更为接近且纯度更高的肾小管上皮细胞，以更好的用于研究急性肾损伤或慢性肾脏病肾小管上皮细胞的损伤机质，以及用于药厂研发药物时药理和毒理的考察。[0004]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其由以下各原料混合而成：500mLDMEM/Ham´sF12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物