实验题目枯草芽孢杆菌的分离.pdf

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实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定

一、实验目的

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜
温，极易分离与培养。由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并
且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治
且备受关注。本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生
理生化特征进行纯化和鉴定及16SrDNA基因序列进行分析。

二、实验原理

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无
荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，
位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在
液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形
成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清
楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
枯草芽孢杆菌的分离方法：
（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐
挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌
的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步
的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、
磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过
试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖
3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度
(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。可利用此方法在培养16小时后分离枯草芽孢杆
菌。
枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定试验主要进行接触酶，V-P反应，糖发酵产酸，水解淀粉，
柠檬酸盐利用，硝酸盐还原，厌氧生长。

三、实验材料和设备

1、培养基
（1）选择性培养基
酵母膏0.5克
蛋白胨0.83克
磷酸二氢钾0.35克
琼脂15克
蒸馏水1000毫升
无水葡萄糖3.5克
PH7.0-7.2
121℃灭菌20min后倒平板
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（2）淀粉培养基
牛肉膏5克
蛋白胨10克
氯化钠5克
可溶性淀粉2克
琼脂15-20克
蒸馏水1000毫升
121℃灭菌20min后倒平板
（3）V—P反应培养基
葡萄糖5克
蛋白胨5克
氯化钠5克
蒸馏水1000毫升
PH6.5
每管分装10ml，121℃灭菌20min
（4）柠檬酸盐培养基
氯化钠1克
七水合硫酸镁0.2克
磷酸二氢铵0.5克
柠檬酸钠2克
琼脂15克
蒸馏水1000毫升
0.04%酚红液20毫升
121℃灭菌20min后倒平板
（5）糖发酵培养基
磷酸氢二铵1克
氯化钾0.2克
硫酸镁0.2克
酵母膏0.2克
琼脂5克
L-阿拉伯糖（D-木糖）10克
蒸馏水1000毫升
溴甲酚紫（0.04%）15毫升
PH7.2
每管分装10ml，121℃灭菌20min
（6）半固体培养基
牛肉膏5克
蛋白胨10克
氯化钠5克
琼脂10克
蒸馏水1000毫升
PH7.0-7.2
每管分装10ml，121℃灭菌20min
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（7）硝酸盐培养基
牛肉膏3克
蛋白胨10克
氯化钠5克
氯化钾1克
蒸馏水1000毫升
PH7.0-7.6
每管分装10ml，121℃灭菌20min
（8）种子培养基
酵母膏5克
蛋白胨10克
氯化钠10克
蒸馏水1000毫升
PH7.0-7.2
121℃灭菌20min
2、试剂
（1）0.9%生理盐水
（2）10%过氧化氢溶液：5ml30%过氧化氢加入15ml蒸馏水
（3）肌酸
（4）40%NaOH溶液
（5）卢哥氏碘液：1g碘，2g碘化钾，300ml蒸馏水
（6）格里斯氏试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150ml
B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，稀醋酸（10%左右）150ml
（7）二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释
（8）PRC试剂：dNTP（10mmol/L），BF（20μmol/L），BR（20μmol/L），10×Buffer（Mg2+Plus）
5，TaqDNA聚合酶，ddH2O。
（9）磷酸缓冲液，Marker，LoadingBuffer
3、仪器设备
培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、接种环、接种针、载玻片、试管架、