DNA重组技术.pdf

DNA重组技术

不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA

recombination）。重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）作为分子生物学的一项

重要技术得到了迅速的发展。利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组

DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行

基因功能研究的基本方法。克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群

体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular

cloning）过程。因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大

致为分、切、连、转、筛选。即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、

酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。

载体选择

载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工

具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已构建成的载

体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同

分为克隆载体和表达载体二类。

载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能

整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段

插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳

较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。④具有合适的筛选标记，

以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成

噬菌斑的能力等。⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。本试

验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有LacZ基因编码区、SP6、

T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于

构建DNA或RNA探针的构建。由于其含β-半乳糖苷酶（LacZ）的α-肽编码区，可进行

蓝/白斑筛选阳性克隆。

本次实验中用的载体是pGEM-3Zf(+)经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，插入一段含400bp左

右的DNA序列的重组载体。本次试验通过对该载体的分、切、连、转、筛选过程处理，以学

习和掌握DNA重组技术。

1

一，质粒载体的分离提取

用质粒提取试剂盒提取质粒，本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱

内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂

质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗

脱。步骤如下：

提示：

第一次使用试剂前先在漂洗液WB中加入指定无水乙醇，充分混匀，加入后请及时打沟标

记，以免多次加入！

将RnaseA全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

将溶液P3放在冰上预冷。

1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30s,尽可能的倒干上清，手机菌液。（收

集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步

骤1，直到收集到足够的菌体）。

2.用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。（如果有未彻底混匀的菌块，会

影响裂解，导致提取量和纯度遍地。）

3.加入250ul的溶液P2,温和地上下翻转4-7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。（温和

地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟！以免质

粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，

2
不是一定要准确的5分钟。）

4.加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰

上静置3-5分钟，13000rpm离心10分钟，小心取上清。（加入溶液P3后应该立即混匀，

以免产生SDS局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。）

5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13000rpm离心30-60s，

倒掉收集管中的废液。

6.加入500ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），2000rpm离心30s，弃掉废液。

7.加入500ul漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中