重组DNA技术.doc

重组DNA实验技术扬州大学兽医学院微生物组二○○六年十月目录实验一质粒DNA小规模制备、定量实验二DNA限制性内切酶酶切、电泳实验三感受态细胞制备实验四PCR及RT-PCR定实验五核酸杂交技术实验六DNA连接、转化及重组DNA的鉴实验七外源基因在大肠杆菌中诱导表达及表达产物的鉴定实验一质粒DNA的小规模制备及定量一、实验目的1、了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理；2、掌握碱裂解法的具体操作方法和注意事项；3、学会常见的DNA定量方法。二、实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。残余的小的RNA分子、一些杂蛋白可用RNAse消化的方法以及饱和苯酚抽提法除去，70%的酒精沉淀DNA，通过离心最终可将DNA浓缩于离心管底部。DNA定量方法常见的有两种，一种是仪器定量法，另一种是比较定量法。仪器定量法，常用紫外分光光度计来进行测量，在260nm波长下，1OD（光密度）的双链DNA为50微克，样品中DNA的含量即为OD260×50ug×稀释倍数；比较法则将样品与已知质量的标准DNA作比较，来初步估计样品中DNA含量，该方法比较粗略。三、仪器、材料与试剂（一）仪器1、微量移液器（20ul，200ul，1000ul）2、恒温摇床3、台式高速离心机4、高压蒸汽灭菌锅5、精密天平（二）材料1、含pUC18的E.coliDH5α菌株2、1.5mleppendorf管及管架、tips3、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、盐酸（HCl）、饱和酚、氯仿、异戊醇、ddH2O、DNAMarker（三）试剂1、LB液体培养基蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g溶于800ml去离子水中，用10NNaOH溶液调节pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压灭菌20分钟。2、溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）3、溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合4、溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL5、RNaseA溶液RNaseA溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5）、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，100℃煮沸15min。6、TE缓冲液10mmol/LTris·HCl1mmol/LEDTA(pH8.0)7、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）8、氯仿溶液氯仿：异戊醇=24∶19、3mol/LNaAc溶液四、实验环节（一）碱裂解法小规模制备质粒DNA1、将菌种接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；2、取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12023r/min离心30sec；3、吸去培养液，使细胞沉淀尽也许干燥；4、将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液I中，剧烈振荡；5、加200ul溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3min；6、加入150uL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min；7、12023r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中；8、加入RNaseA溶液2ul，37℃作用30min，去除RNA；9、加入等体积饱和酚/氯仿溶液（约400ml），振荡混匀，12023r/min离心5min，小心移出上层水相于一新Eppendorf管中；10、向上清夜加入2倍体积乙醇、1/10体积的3mol/LNaAc溶液，混匀后，-20℃放置10-15min。12023r/min离心10min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体；11、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥；12、50ulTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。（二）DNA定量1、选择波长260nm，预热紫外分光光度计10分钟左右；2、用“调零”钮调零点；3、空白样液（TE溶液）置于光路中，盖好样品室盖，调节