实验十三 细菌的生理生化反应 - 成都大学..pdf

实验十三细菌的生理生化反应

甲基红试验、糖发酵试验、淀粉水解试验，试验，
H2S
一、实验目的
1．了解细菌鉴定中常用的主要生理生化反应试验法及其原理。
2．比较4种菌的大分子水解实验结果。
3．比较4种菌的甲基红反应结果。
4．学习如何使用杜氏小管进行糖发酵试验，并比较3种菌的糖发酵试验结果。
二、实验原理
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的
底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在
很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧
化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产
酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来
判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH5．2为黄色，pH6．8为紫色)，当发酵产酸时，使培养
基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验
证。
三、实验器材
１．大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌的斜面菌种。荧光假单胞菌
（Pseudomonasfluorescens）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureuse），
2．葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)；淀
粉培养基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培养基。40％NaOH溶液、甲基红试
剂、1.6％溴甲酚紫指示剂。
3．超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、试管、移液管，杜氏小管。
四、实验方法
（一）甲基红试验：
1．试管标记取5支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆
菌、普通变形菌，枯草芽孢杆菌和空白对照。
2．接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照不接菌。置
37℃恒温箱中，培养24～48h。
3．观察记录取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～
5mL以上对应管中的培养液，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培
养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应，若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“+”
或“一”表示。
（二）糖发酵试验：
1．试管标记
2．接种培养
3．观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该
菌不能利用该种糖，记录用“-”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解
该种糖产酸，记录用“+表示”。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖
能产酸并产气，记录用“⊕”示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“☉”表示。
（三）淀粉水解试验
（一）淀粉水解试验

某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收
利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色。

试验时将装有淀粉培养基的三角瓶置于洗水浴中融化，然后取出冷却至约50℃左右，
即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。每个同学用接种环取少量菌涂在平板上，每个菌种涂
片0.3～0.5cm大小的圆（见图14-1）、其中一种应以枯草杆菌（Bacillussubtilis）作为对照
菌。

图14－1淀粉水解试验接种示意图

1.枯草芽孢杆菌2.试验菌13.大肠杆菌4.试验菌2

将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h，观察时打开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻
旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明
圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。
（四）硫化氢的产生试验
许多细菌能从培养基中的含硫有机化合物产生硫化氢。硫化氢遇铅盐（或铁盐）则形成
黑色硫化铅（或黑色硫化铁）。试验常用胱氨酸或半胱氨酸作为含硫有机物。
1．方法
接种与观察：用新鲜斜面培养物（菌种）接种到硫化氢试验培养基中。接种后，用无菌
镊子夹取醋酸铅滤纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接进培养基表面，不接触液面，适
温培养。于接种后3、7、14天观察，纸条变黑者为阳性，不变者为阴性。
2.注意事项
a.此方法比较敏感，本培养基不适用于肠杆菌科。
b.纸条高度应放置适当，离液面太远影响灵敏度，太近容易被溅湿。同时移动试管时也
要平稳。
c.除空白对照外，应放阴性对照。
（五）石蕊牛奶试验
牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳
糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。中性时石
蕊呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。
细菌对牛乳的利用可分三种情况：
1.酸凝固作用
细菌发酵乳糖后，产生