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细菌鉴定中常用的生理生化反应生命科学学院生02孙禹2010012376实验日期：2012-4-9同组姓名：张宇成、冯佳界一、实验目的1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法2、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义4、学习各种接种技术二、实验原理各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。用生理生化实验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。本次实验中所用方法及原理如下：（一）糖类发酵实验糖分解实验是鉴别微生物是常用的生理生化反应。绝大多是细菌都能利用糖类作为碳源和能源。但是各种细菌对所具有的相应酶系统不尽相同，对不同糖类的利用能力和方式也存在差异。例如有些细菌能发酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些会产生有机酸或气体。在培养基中预先加入溴甲酚紫，当发酵产酸时，培养基由紫色变为黄色；气体产生可以由杜氏小管来证明。（二）甲基红(MethylRed)（M.R.实验）甲基红实验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当产生酸性物质时，培养基在加入甲基红之后呈红色；若酸性较弱或者没有产酸，则呈黄色。有些细菌(如大肠杆菌等)分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌(如产气杆菌)在培养的早期产生有机酸，但在后期将有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。（三）V.P.试验(伏―普试验)V.P.实验是用来测定某些细菌以用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含胍基作用，生成红色化合物，即为V.P.阳性。（四）靛基质(吲哚)实验某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。（五）硫化氢实验某些细菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢实验阳性。（六）明胶液化实验蛋白质和氨基酸一般作为微生物的氮源外，但是当缺乏糖类物质时，它们也可作为微生物的碳源和能源。明胶是由蛋白质经水解产生，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25℃以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种称为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。（七）淀粉水解实验微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解成小分子物质才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小的化合物，使其能被运输到细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程可以通过观察细菌菌落周围物质的变化来证实。如可以用滴加碘液到菌落周围看是否变蓝色来检查是否产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸会使培养基pH下降，可以在培养基中事先加入中性红试剂，培养基会从淡红色变为深红色。（八）柠檬酸盐利用实验柠檬酸盐培养基是一综合性培养基，其中柠檬酸钠是唯一的碳源，而磷酸二氢铵是唯一的氮源。有的细菌如产气杆菌，能力有柠檬酸钠，因此能在该培养基上生长，分解柠檬酸盐并产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。三、实验仪器、材料和用具仪器和用具：37℃恒温培养箱、4℃冰箱、接种环、酒精灯、打火机、试管架试管（每个实验3根实验管，1根对照管，共8个实验）、杜氏小管、记号笔材料和试剂：甲基红试剂、V.P.试剂(40%KOH、5%α-萘酚)、吲哚试剂、碘液、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌液、变形杆菌(Proteusvulgaris)菌液、枯草杆菌(Bacillussubtilis)菌液、产气杆菌(Aerobacteraerogenes)菌液、待鉴定的未知菌S3菌液，平板挑菌得到的未知菌。四、实验步骤1、配制培养基(已于前一次课完成)葡萄糖/乳糖发酵培养基（用于葡萄糖发酵实验）表1葡萄糖/乳糖发酵培养基蛋白胨10gNaCl2.5g水500ml制法：①将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整pH至7.4—7.6。②加葡萄糖/乳糖5g，加热溶解后加入0.5ml的1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，混匀。③配好的培养基分装到试管中，每支5ml。内倒置配排净空气的杜氏小管，0.06MPa、30min灭菌。葡萄糖蛋