一种NADPH氧化酶突变体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948355A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211649389.3C12N1/21(2006.01)(22)申请日2022.12.21C12P19/36(2006.01)C12R1/19(2006.01)(71)申请人中山百灵生物技术股份有限公司地址528400广东省中山市火炬开发区九洲大道28号申请人中山俊凯生物技术开发有限公司(72)发明人余允东张和平吴伟业李小莲陈佩欣(74)专利代理机构广东金穗知识产权代理事务所(普通合伙)44852专利代理师赵李娜(51)Int.Cl.C12N9/02(2006.01)C12N15/53(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）(54)发明名称一种NADPH氧化酶突变体及其应用(57)摘要本发明公开了一种NADPH氧化酶突变体及其应用，属于生物酶工程技术领域。所述突变体为在SmNOX的基础上，通过同源建模技术和定点饱和突变技术筛选得到；所述突变体为在氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的NADPH氧化酶进行定点突变得到，所述点突变为T114E、I116F或P118S，对应的氨基酸序列如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示。本发明得到的3种SmNOX酶突变体的单位酶活为4.6～6.0U/mg，较原SmNOX酶提高1.4～1.9倍，可更有效地用于相关的氧化还原反应中，在制药、食品、精细化工、农药等领域有良好的应用前景。CN115948355ACN115948355A权利要求书1/1页1.一种NADPH氧化酶突变体，其特征在于，所述NADPH氧化酶突变体为在氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的NADPH氧化酶进行定点突变得到，所述点突变为T114E、I116F或P118S，对应的所述NADPH氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示。2.如权利要求1所述的NADPH氧化酶突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示。4.含有如权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。5.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的载体骨架包括pET、pCW、pUC和pPIC9k中的其中一种。6.包含如权利要求2或3所述编码基因的重组细胞。7.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞采用的宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌和枯草芽孢杆菌中的其中一种。8.如权利要求1所述的NADPH氧化酶突变体，如权利要求2或3所述的编码基因，如权利要求4或5所述的重组表达载体，如6或7所述的重组细胞的用途。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，用于生产辅酶NADP+。10.一种生产辅酶NADP+的方法，其特征在于，包括如下步骤：取NADPH和如权利要求1所述的NADPH氧化酶突变体，加入pH7.0磷酸钠缓冲液中。2CN115948355A说明书1/5页一种NADPH氧化酶突变体及其应用技术领域[0001]本发明属于生物酶工程技术领域，涉及一种NADPH氧化酶，尤其是一种NADPH氧化酶突变体及其应用。背景技术[0002]氧化还原酶是一类重要的生物催化剂，在制药、食品、精细化工、农药等领域都具有重要的用途，主要是用来制备手性化合物，例如羟基酸类、氨基酸、类固醇、手性醇类等等。氧化还原酶在进行生物催化时，辅酶(NAD,NADP)起着电子转移的作用，随着反应的继续进行，辅酶会逐渐减少，最终导致反应中止，要继续反应，就需要不停的补充辅酶，所以辅酶的高效供应是开发氧化还原酶催化反应的关键技术之一。但是辅酶价格昂贵，在生产过程中大量投加补充辅酶显然是不切实际的。因此，从工业应用的经济效益角度来看，氧化还原酶在应用中除了必须有合适的酶和反应工程技术以外，还必须提供高效、低成本的辅酶再生系统。[0003]辅酶再生，就是把辅酶从氧化态再生为还原态，或者反之，从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。为了解决辅酶再生这一问题，已经提出一系列的方法，包括化学、光化学、酶学和电化学等再生系统，其中酶法再生系统具有反应条件温和、催化效率低、环境友好等优点而受到广泛重视。在常见的氧化态辅酶再生体系中，NAD(P)H氧化酶是极具潜力的氧化型辅酶再生体系之一，因为NAD(P)H氧化酶能直接使用分子氧作为氧化剂，不需要其他辅助底物或介质，从而降低成本；产物为水或者过氧化氢，无需处理副产物或副产物处理简单，十分有利于在工业生产中应用。[0004]本发明旨在开发一种用于NADP+高效再生的氧化酶，选择NAD(