酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114736881A(43)申请公布日2022.07.12(21)申请号202210648730.7C12N15/53(2006.01)(22)申请日2022.06.09C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)(71)申请人中国农业科学院北京畜牧兽医研究C12R1/84(2006.01)所地址100193北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人涂涛黄火清闫亚茹张伟姚斌罗会颖柏映国王苑苏小运王亚茹张杰秦星王晓璐张红莲于会民(74)专利代理机构北京法信智言知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11737专利代理师尹超群(51)Int.Cl.C12N9/04(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表25页附图3页(54)发明名称酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用(57)摘要本发明属于饲料生物技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶GoxM10的酸稳定性提高的突变体A4D及其衍生突变体和应用。本发明以高热稳定性葡萄糖氧化酶GoxM10为研究材料，采用蛋白质工程改造技术对其进行酸稳定性的改良研究。最后获得酸稳定性提升的突变体，从而促进了Gox在饲料工业中的应用。CN114736881ACN114736881A权利要求书1/1页1.酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D、或S133E、或Q581E、或N471E突变的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/S133E突变的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/Q581E突变的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/N471E突变的氨基酸序列。5.一种葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1‑4中任意一项所述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体。6.包含权利要求5所述葡萄糖氧化酶基因的重组载体。7.包含权利要求5所述葡萄糖氧化酶基因的重组菌株。8.一种制备酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：构建包含编码权利要求1‑4中任意一项所述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体的基因的重组载体；将所述重组载体导入宿主细胞；诱导表达、并分离葡萄糖氧化酶。9.一种改善葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D、或S133E、或Q581E、或N471E突变的步骤。10.根据权利要求9所述的改善葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/S133E突变的步骤；或将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/Q581E突变的步骤；或将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/N471E突变的步骤。2CN114736881A说明书1/5页酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用技术领域[0001]本发明属于饲料生物技术领域，具体涉及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用。背景技术[0002]葡萄糖氧化酶（Gox；EC1.1.3.4）是一种特性良好的需氧脱氢酶，在有氧条件下利用氧分子作为电子受体，催化β‑d‑葡萄糖生成d‑葡萄糖酸内酯和过氧化氢，随后d‑葡萄糖酸内酯水解成葡萄糖酸和水。近年来Gox作为一种新型抗生素替代添加剂受到饲料行业的普遍关注。Gox作为抗生素和生长促进剂的替代品，在不损害人类健康的前提下对保证动物健康和生产性能至关重要。大量应用研究表明，Gox作为一种绿色饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染和腹泻，并有促进动物生长的作用。[0003]当前大部分动物饲料均需要经过高温制粒，所以提高Gox的热稳定性对于其在饲料中的广泛应用至关重要。此外，能够在酸性环境中维持较高的活性，以便在动物胃肠道发挥最大作用也至关重要。所以为了满足Gox在饲料工业中的应用，Gox要具备良好的热稳定性和酸稳定性。对于黑曲霉（Aspergillusniger）来源Gox稳定性改进，现