一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108977582A(43)申请公布日2018.12.11(21)申请号201810950769.8(22)申请日2018.08.20(71)申请人中国动物卫生与流行病学中心地址266032山东省青岛市南京路369号(72)发明人王楷宬王素春黄保续(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法(57)摘要本发明提供一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，所使用的引物对和探针组，引物和探针具有序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:3的碱基序列。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽传染性支气管炎病毒的方法，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBRGreen染色法造成的污染和低特异性。CN108977582ACN108977582A权利要求书1/1页1.一种引物对和探针组，其特征在于，所述引物对和探针的序列信息如下：正向引物IBV-F：5′-TTGAAGGTAGYGGYGTTCCTGA-3′、反向引物IBV-R：5′-CAGMAACCCACACTATACCATC-3′、探针IBV-Probe：5′-ACWGGAACAGGACCDGCCGCTGACCT-3′。2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测禽传染性支气管炎病毒的制品中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量检测试剂盒。5.一种用于检测禽传染性支气管炎病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒使用了权利要求1或2所述的引物对和探针组。6.一种检测临床样品中禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)配置荧光定量RT-PCR反应体系反应液每管25μL，含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL，5U/μLTaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μL，10pmol/μL权利要求1所述的正向引物IBV-F、反向向引物IBV-R和探针IBV-Probe各0.5μL，RNaseFreedH2O8μL，待检测的样品RNA模板2μL；2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；保存文件，运行；3)结果判定结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。2CN108977582A说明书1/5页一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括鉴定禽传染性支气管炎病毒的引物对探针。背景技术[0002]鸡传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)可引起鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，即鸡传染性支气管炎。该病以咳嗽、气管啰音和打喷嚏为主要特征，是对我国养鸡业危害最为严重的病毒性传染病之一，该病几乎在世界范围内所有的养鸡国家存在，在我国的流行呈上升趋势。IBV血清型众多，目前已报道30余种，不同血清型毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，相互间没有或仅有部分交叉免疫性，尤其是近些年，新的血清型不断出现，急需能够检测所有血清型的高通量检测方法用于临床诊断。传统检测方法已不适于现代疫病监测和诊断的需要，急需制定能够高通量检测、结果易于判定的荧光RT-PCR检测技术标准，用