BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测.doc

生物化学大实验结题报告BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测学生姓名：学号：年级：专业：指导教师：完成时间：BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测摘要：BAP能催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，是分子生物学中常用的底物专一性低的磷酸单酯酶。将BAP克隆在含有lac启动子的表达载体中，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）可使得阻遏蛋白不能与操纵基因结合，让其在E-coli中大量转录并表达。对细菌进行超声波破碎以后用亲和层析柱对其进行分离纯化，对其表达的蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting，用作特性分析。最后通过与BAP标准样品的比较计算出其活力。关键词：BAP；分离纯化；SDS-PAGE；Western-blotting细菌性碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/63162.htm"\t"_blank"底物HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3853058.htm"\t"_blank"去磷酸化的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1326.htm"\t"_blank"酶，即通过水解HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/46468.htm"\t"_blank"磷酸单HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/132901.htm"\t"_blank"酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/63017.htm"\t"_blank"离子和自由的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/27034.htm"\t"_blank"羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适pH是8.0。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。1材料与方法1.1菌种及实验用相关试剂大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)，由生化实验室提供。葡聚糖G-75干粉、Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）、startingbuffer、咪唑、Marker、PVDF膜、TBS、吐温、一抗、酶标二抗，均由生化实验室提供。其它生化试剂和常规试剂均为分析纯。1.2装柱及标准样品的分子筛层析把柱子固定在夹子上，打开上面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液400mL（80mmolTris-HCl,pH8.0;8mmolNaCl）。待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。平衡柱过中午。缓慢向柱中加入样品1ml（牛血清蛋白(68kd)、糜蛋白酶(25kd)二者比例为2:1，溶于200mmolTris-HCl，pH8.0;20mmolNaCl）打开层析柱上端及下端的连接管，使样品靠重力流出。当样品接近界面时，在柱中加入3ml上样缓冲液，连接泵，调T=100A(0.5A)=0，开启记录仪，同时配制100ml0.1MNacl。待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1MNacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。1.3BAP的诱导表达首先进行预培养在5mlLB培养基中加入Amp5μl和10μl菌液。在摇床上37℃130转过夜预培养。取2.5ml菌液加入50mlLB培养基（含有50μlAmp），1:20扩培。37℃恒温摇床，190rpm培养40min。当OD600值达到0.5-0.7时，进行诱导表达，即加入工作浓度为1mM的IPTG(500ul)进行外源基因的诱导表达。于室温诱导5小时。留样1ml，其余放入冰箱于4度保存。1.4超声波破碎诱导后的菌体，5000rpm离心15min，弃上清。加入1/10体积的破碎缓冲液洗涤。5000rpm离心15min去上清，加入破碎缓冲液及终浓度为50μl/5m