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胰岛素的分离纯化及其质量检测

通过比较发现，离子交换树脂法为提取胰岛素最佳方法，但该法成本高，所用材料的花费及产物得率不平衡，而酸-醇提取减压浓缩法能做到最大地节约成本和带来经济效益，所以投入同样的费用和精力，酸-醇提取减压浓缩法所获得的经济效益最大。因此，对于提取胰岛素来说，最好的方法就是酸-醇提取减压浓缩法。
1.具体操作方法【1】(酸-醇提取减压浓缩法)：
（1）称取冰胰块100g，用组织捣碎机刨碎，加86%乙醇230ml和5%草酸230ml，在10-l5℃搅拌提取3h，用纱布过滤，留滤渣，滤液在4000r/min下离心5min，取上层清液。滤渣再用115ml的68%乙醇和115ml0.4%草酸提取2h，同上法操作。合并两次乙醇提取液。
（2）在l0-l5℃下不断搅拌提取液并加入浓氨水调pH8.0-8.4，立即进行压滤，除去碱性蛋白，此时滤液澄清，及时用硫酸酸化至pH3.6-3.8，并降温至5℃，静置4h，使酸性蛋白充分沉淀。
（3）吸上层清液至另一烧杯中，下层用帆布过滤，弃去沉淀物。滤液并人上清液，在30℃以下真空抽滤以除去乙醇，浓缩液体积约为原体积的1/9-1/10。
（4）浓缩液转入坩埚内于5min内加热至50℃，立即用冰盐水(20%NaCl溶液)降温至5℃，静置3-4h，用分液漏斗分离出下层清液(脂层可回收胰岛素)。用4mol/L的HC1调至pH2.3-2.5，并于20-25℃搅拌下加人27%固体氯化钠，保温静置12h。析出之盐析物为胰岛素粗品。
（5）盐析物称干重为27.3mg，加人200ml蒸馏水溶解，再加入10ml的冷丙酮，之后用4mol/L氨水调pH4.2-4.3，然后补加丙酮50ml，使溶液中水和丙酮的比例为7:3。充分搅拌后低温放置过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在低温下离心分离。
（6）在滤液中加入4mol/L氨水使pH为6.2-6.4，加入3.6%的醋酸锌溶液，此时溶液浓度为20%。再用4mol/L氨水调pH至6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。
（7）将沉淀过滤，用冷丙酮洗涤，得沉淀110.7mg，再加冰冷2%柠檬酸5ml，6.5%醋酸锌溶液0.2ml，丙酮1.6ml，并用冰水稀释至10ml，使充分溶解，冷却至5℃以下，用4mol/L氨水调至pH8.0，并迅速过滤，滤液立即用10%柠檬酸溶液调至pH6.0，补加丙酮，保持丙酮含量为16%，慢速搅拌3-5h使结晶析出。
在显微镜下可观察到外形为似正方形或扁斜形的六面体结晶，再转入5℃左右冰箱中放置3-4d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，自然风干，即得结晶胰岛素。
郭君等通过正交实验优化了提取工艺，结果表明，用丙酮、水、氯化钙为提取溶剂，酸化时pH为3.8，碱化时pH为8.0，提取效果最好，经过三次实验（每次用25.00g猪胰脏），提取得到的胰岛素分别为150.552U，152.378U，153.021U。平均值为151.987U，RSD=0.85%【2】。
2.效价检测
用离子交换高效液相色谱对胰岛素进行效价检测。将所得结晶性粉末用一定量的流动相溶解，取5Oul上柱，用NaCl进行线性梯度洗脱，测定胰岛素与脱酰胺胰岛素的峰面积，以胰岛素国家标准品做对照求得其相对效价。此法可在较短的时间内同射测定多个样品，消除测定中的偶然误差，结果与生物检定法较为一致【3】。
3.纯度检测
将胰岛素粉末用保温液稀释至适当浓度，使测定值位于标准曲线的实用段。一次加入所有反应成份后保温，加沉淀分离剂沉淀，吸弃上清液，测定B(沉淀放射性)/T(每管加入的放射性)值与标准曲线对照，得胰岛素原的含量，其分析灵敏度一般在10-9-10-12g，较过去常用的圆盘电泳法为优【3】。
4.产品质量分析
制备的胰岛素应符合最新的《中国药典》标准，如下【4】：

参考文献：
【1】范树国,魏朔,李国树等.不同方法提取猪胰岛素得率的比较.大理学院学报[J].2009.8(6):20-23
【2】郭君,杨孝辉.正交实验优化猪胰脏中胰岛素的提取工艺.广州化工[J].
2011.39(11):93-95
【3】李志宁,乔德水.单峰纯胰岛素柱色谱纯化条件的探讨.中国医药工业杂志[J].1992.23(7):294-296
【4】李晓红,余蓉,杨继虞等.单组分胰岛素的制备及质量分析.四川大学学报[J]2005.42(1):175-178