一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108728396A(43)申请公布日2018.11.02(21)申请号201810603594.3(22)申请日2018.06.12(71)申请人华中农业大学地址430000湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人程运江李欣柴应芳许让伟王鹏蔚田真曾云流邓秀新(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569代理人刘奇(51)Int.Cl.C12N5/04(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图9页(54)发明名称一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法(57)摘要本发明提供了一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法，涉及植物生物化学技术领域。本发明所述方法以Percoll为梯度介质应用差速离心结合密度梯度离心分离和纯化柑橘果肉线粒体，包括以下步骤：1)将柑橘果肉与缓冲液A混合后榨汁，过滤得过滤液；2)将得到的过滤液进行差速离心，得到的沉淀用缓冲液B进行悬浮，得到样品I；3)将得到的样品I进行密度梯度离心，得到样品II；4)将得到的样品II与缓冲液B混合，离心收集沉淀，得样品III；5)将得到的样品III与缓冲液B混合，离心收集沉淀，得柑橘果肉线粒体。本发明得到的线粒体呈典型的椭球状，双层膜结构完整，嵴清晰可见，且线粒体提纯方法纯度高，提纯效果好。CN108728396ACN108728396A权利要求书1/1页1.一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法，包括以下步骤：1)将柑橘果肉与缓冲液A按照1g:1～5mL的料液比混合后榨汁，固液分离得过滤液；所述缓冲液A为包括以下成分的水溶液：0.3～0.5M的山梨醇、0.15～0.5M的3-(N-玛琳代)丙磺酸、1～10mM的乙二胺四乙酸、1～10mM的二硫苏糖醇、质量体积比为1～5％的聚乙烯吡咯烷酮和质量体积比为0.05～1％的牛血清蛋白；2)将步骤1)得到的过滤液进行差速离心，所述差速离心后得到的沉淀用缓冲液B进行悬浮，得到样品I；所述缓冲液B为包括以下成分的水溶液：0.3～0.5M的山梨醇和20～60mM的3-(N-玛琳代)丙磺酸；3)将步骤2)得到的样品I与用缓冲液C稀释的Percoll梯度稀释液混合，进行密度梯度离心，收集线粒体层，得到样品II；所述缓冲液C为包括以下成分的水溶液：0.6～1.0M的山梨醇和40～120mM的3-(N-玛琳代)丙磺酸；4)将步骤3)得到的样品II与所述缓冲液B混合，离心后收集沉淀，得样品III；5)将步骤4)得到的样品III与所述缓冲液B混合，离心后收集沉淀，得柑橘果肉线粒体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柑橘包括橙、柑、橘或柚。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述缓冲液A的pH值为7.5～8.0。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述差速离心的次数为两次。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述差速离心的步骤包括：a)将所述过滤液在1000～1800g离心力下进行第一离心，收集第一上清液；b)将所述第一上清液在2500～5000g离心力下进行第二离心，收集第二上清液；c)将所述第二上清液在10000～17000g离心力下进行第三离心，收集沉淀。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)、步骤4)及步骤5)所述缓冲液B的pH值独立地为7.2～8.0。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用缓冲液C稀释的Percoll梯度稀释液中Percoll的体积分数为35％、22.5％和18％。8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述缓冲液C的pH值为7.2～7.8。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述密度梯度离心的转速为18000～22000rpm，时间为40～80min。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)和步骤5)所述离心的离心力独立地为12000～17000g，时间独立地为12～20min。2CN108728396A说明书1/9页一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法技术领域[0001]本发明属于植物生物化学技术领域，具体涉及一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法。背景技术[0002]线粒体作为一种重要的细胞器，是细胞代谢的动力工厂，在其中不断进行着电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化，为其它代谢提供三磷酸腺苷(ATP)和代谢中间产物，因此与果实的呼吸作用和能量代谢密切相关。柠檬酸为三羧酸循环的一个重要产物，也是柑橘类果实最主要的有机酸，其含量高低直接决定着果实的风味品质。线粒体电子传递链复合物Ⅰ和Ⅲ是活性氧(ROS)产生的主要位点，进而影响果实的采后生理及衰老进程。此外，线粒体也参与了氨基酸代谢、维生素和脂质的合成、生物和非生物胁迫的响应等重要生理过程。因此，分离得到纯度