一种检测南非2型口蹄疫病毒抗体的试剂盒及制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109799341A(43)申请公布日2019.05.24(21)申请号201811491851.5(22)申请日2018.12.07(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号(72)发明人郭慧琛张韵孙世琪董虎白满元侯凤萍茹嘉喜(74)专利代理机构兰州振华专利代理有限责任公司62102代理人张晋(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页(54)发明名称一种检测南非2型口蹄疫病毒抗体的试剂盒及制备方法(57)摘要本发明公开一种采用南非2型口蹄疫病毒样颗粒（VLPs）制备的检测试剂盒及制备方法。本发明的试剂盒的制备方法是将HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其内酶标板包被的南非2型口蹄疫病毒样颗粒是由南非2型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成。本发明采用的VLPs能高效组装，且不影响其诊断效率，有利于降低诊断制剂的成本。本发明方法相对现有技术的检测步骤有所减少，实验操作简单，工作量小，用时短，并可提高诊断试剂的特异性和敏感性。CN109799341ACN109799341A权利要求书1/1页1.一种南非2型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒内包括有：包被南非2型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板，HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。2.权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其制备过程包括：用南非2型口蹄疫病毒样颗粒免疫兔，免疫结束后，从兔心脏采血，分离血清并用ProteinA亲和层析法分离纯化得到IgG，采用过碘酸钠方法将HRP标记到IgG上。3.根据权利要求2所述的南非2型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于试剂盒内的酶标板包被的南非2型口蹄疫病毒样颗粒是由南非2型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成，VP0、VP1和VP3的序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。4.根据权利要求2或3所述的南非2型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于其中的酶标板制备是用0.05%pH=9.6的碳酸盐包被缓冲液将南非2型FMDVVLPs稀释为0.4µɡ/mL，以每孔100µL的量加入酶标板，4℃包被过夜，洗涤液洗板3次；加入以酶标板稳定剂配制的含1%BSA封闭液，每孔120µL，37℃恒温箱封闭30min，洗板3次，干燥，真空包装。2CN109799341A说明书1/5页一种检测南非2型口蹄疫病毒抗体的试剂盒及制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种南非2型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒。背景技术[0002]口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美洲均有发生，造成了巨大的经济损失，世界卫生组织将口蹄疫列为法定上报传染病。南非2型口蹄疫病毒(SAT2)是口蹄疫病毒属，小RNA病毒科的成员之一，该病毒主要在非洲南部和西部地区爆发，严重威胁周边地区畜牧业的发展。最近几十年在非洲大陆以外的周边地区相继出现南非2型口蹄疫病毒的报道，这就说明该病毒已经出现了跨境传播的危险，2000年科威特和沙特出现了SAT2口蹄疫的疫情，2012年巴基斯坦和巴林岛也有SAT2口蹄疫病例出现。由此可见，SAT2-FMDV正威胁着世界各个国家，所以对于SAT2口蹄疫的预防、诊断就显得尤为重要。[0003]病毒样颗粒(Viruslikeparticles，VLPs)作为最接近自然病毒粒子但不含病毒基因的类病毒颗粒在多个研究领域尽显其优势。病毒的衣壳蛋白或膜蛋白组装成VLPs后，可以作为抗原对抗体进行检测。组装后的VLPs通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立体构象，因此相对于单个病毒蛋白，使用VLPs对抗体进行检测具有更高的灵敏度和特异性。并且VLPs具有类似天然病毒的结构，具有很强的免疫原性，以VLPs免疫动物可以获得高滴度的抗体,这种抗体可以用于相应病毒的免学检测。[0004]口蹄疫的血清学诊断技术是在流行病学调查技术体系中应用最为广泛的技术手段,它不仅能够在口蹄疫暴发和流行时结合其他血清学方法对疫情进行预测和判断,而且能够在口蹄疫疫苗免疫效力评估中发挥主要作用。目前,我国口蹄疫结构蛋白抗体检测主要用途是口蹄疫疫苗免疫效力评估。2004年OIE公布的口蹄疫血清学检测方法有三种:病毒中和试验(VNT