一种O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109799342A(43)申请公布日2019.05.24(21)申请号201811491852.X(22)申请日2018.12.07(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号(72)发明人郭慧琛白满元孙世琪张韵茹嘉喜杨志元(74)专利代理机构兰州振华专利代理有限责任公司62102代理人张晋(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页(54)发明名称一种O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒(57)摘要本发明公开一种采用O型口蹄疫病毒样颗粒（VLPs）制备的检测试剂盒及制备方法。本发明的试剂盒的制备方法是将HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其内酶标板包被的O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和经优化的VP3组装而成。本发明采用的VLPs能高效组装，且不影响其诊断效率，有利于降低诊断制剂的成本。本发明方法相对现有技术的检测步骤有所减少，实验操作简单，工作量小，用时短，并可提高诊断试剂的特异性和敏感性。CN109799342ACN109799342A权利要求书1/1页1.一种O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒内包括有：包被O型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板，HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。2.权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其制备过程包括：用O型口蹄疫病毒样颗粒免疫4~5周龄兔，免疫结束后，从兔心脏采血，分离血清并用ProteinA亲和层析法分离纯化得到IgG，采用过碘酸钠方法将HRP标记到IgG上。3.根据权利要求2所述的O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于内酶标板包被的O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成。4.根据权利要求3所述的O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于VP3的序列为SEQIDNo.3。5.根据权利要求2或3或4所述的O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于其中的酶标板制备是用0.05%（pH=9.6）的碳酸盐包被缓冲液将O型FMDVVLPs稀释为0.5µg/mL，以每孔100µL的量加入酶标板，4℃包被过夜，洗涤液洗板3次；加入以酶标板稳定剂配制的含1%BSA封闭液，每孔120µL，37℃恒温箱封闭1h，洗板3次，干燥，真空包装。2CN109799342A说明书1/7页一种O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及一种病毒检测试剂盒及其制备方法，确切讲本发明涉及一种采用O型口蹄疫病毒样颗粒（VLPs）制备的检测试剂盒及制备方法。背景技术[0002]口蹄疫(Foot-and-mouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthDiseasevirus,FMDV）引起的一种常发生于偶蹄动物的高度接触性传染性疾病，且人兽共患。FMDV宿主范极广，易感动物可达70多种。该病可通过空气等多种途径传播，传播迅速，发病率100%，可造成世界范围内的大流行。其发病症状主要表现在蹄部、口部、乳房等部位发生水泡、流涎、体温身高或水泡损伤后形成溃疡或结痂等，严重时表现出跛行和卧地等症状。因此，FMD造成养殖业生产力大幅度下降。该病每年造成世界的巨大经济损失，并且影响国际贸易关系和动物进口贸易关系，素有“政治经济病”之称。国际动物卫生组织（OIE）将FMD列为法定上报传染病，同样我国农业部将其列为一类传染病之首。OIE和联合国粮农组织（FAO）将FMD列为首要防控动物疾病，并启动FMD全球防控计划，鼓励各国各地区制定官方防控策略。FMD存在多个血清型及亚型，且不同型之间几乎不存在交叉免疫反应，许多动物无临床症状但带毒严重。因此，快速、高效的诊断和监测隐性带毒动物对FMD的防控至关重要，也是该病防控的首要环节。[0003]口蹄疫诊断检测技术的发展历程可分为3个阶段，即早期的病毒分离实验，补体结合实验和病毒中和实验，中期发展起来以酶联免疫吸附试验为核心的病原和抗体检测方法，现今以聚合酶链式反应（PCR）为基础的多种分子学诊断技术。早期的补体结合试验和病毒中和试验等被普遍认为是实验室诊断FMD的经典方法。其检测的检测结果一般准确可靠，但是也存在时间长，工作量大，试验步骤复