基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109799343A(43)申请公布日2019.05.24(21)申请号201811492102.4(22)申请日2018.12.07(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号(72)发明人郭慧琛孙世琪白满元张韵张禹茹嘉喜杨志元王蕊何继军罗建勋(74)专利代理机构兰州振华专利代理有限责任公司62102代理人张晋(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页(54)发明名称基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒(57)摘要本发明公开一种采用A型口蹄疫病毒样颗粒（VLPs）制备的检测试剂盒及制备方法。本发明的A型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒内包括有：包被A型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板，HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。本发明相对现有技术具有更好的安全性、良好的免疫原性，以及更高的灵敏度及特异性。CN109799343ACN109799343A权利要求书1/1页1.一种A型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒内包括有：包被A型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板，HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。2.权利要求1所述的A型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其制备过程包括：用A型口蹄疫病毒样颗粒免疫兔，免疫结束后，从兔心脏采血，分离血清并用ProteinA亲和层析法分离纯化得到IgG，采用过碘酸钠方法将HRP标记到IgG上。3.根据权利要求2所述的A型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于酶标板包被的A型口蹄疫病毒样颗粒是由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成，VP0、VP1和VP3的序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。4.根据权利要求2或3所述的A型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于其中的酶标板制备是用0.05%（pH=9.6）的碳酸盐包被缓冲液将A型FMDVVLPs稀释为1.0µɡ/mL，以每孔100µL的量加入酶标板，4℃包被过夜，洗涤液洗板3次；加入以酶标板稳定剂配制的含1%BSA封闭液，每孔120µL，37℃恒温箱封闭1h，洗板3次，干燥，真空包装。2CN109799343A说明书1/5页基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其制备方法，确切讲本发明涉及一种采用A型口蹄疫病毒样颗粒（VLPs）制备的检测试剂盒及制备方法。背景技术[0002]口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病，其主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaI7个血清型，而这7个血清型间几乎没有交叉免疫保护反应。由于FMD传播速度极快，血清型和基因型不断的变化，且血清型之间不存在交叉保护性，给口蹄疫防控带来了极大的挑战。近年来，A、O型在中国部分地区以交替流行的态势出现，且其疫情复杂、涉及面广、破坏性强。我国新疆的阿克苏地区及韩国等地在2009-2013年间相继出现A型口蹄疫疫情；2013年3月广东茂名某猪场出现了A型口蹄疫临床发病病例，之后便在我国的某些省份及周边国家俄罗斯、哈萨克斯坦相继发生疫情，造成了重大的经济损失。目前预防口蹄疫最有效的方法是接种疫苗，主要根据地区性流行毒株的亚型，进行大规模地调查了解有关流行毒株的抗原漂移、转移等特性，选择匹配的疫苗株来免疫接种动物，为防控动物口蹄疫疾病，需要有效的方法来精确快速地检测动物感染的病原和疫苗免疫水平，因此，一种稳定可靠的检测方法显得尤为重要。[0003]目前用于检测FMDV抗体的ELISA方法大多是以灭活病毒、重组病毒、单个蛋白或多肽等作为抗原，以完整病毒粒子作为抗原虽具有许多优点，但却存在安全风险，而单个蛋白或多肽的免疫原性相对较差，影响其使用的效果。[0004]现阶段大多数竞争ELISA试剂盒都是将HRP标记在抗竞争性抗体的抗体上，这就导致它们的实验步骤多，用时长，多在1h以上，参见中国专利申请CN105445457A、CN107064501A等