一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109880847A(43)申请公布日2019.06.14(21)申请号201910205909.3(22)申请日2019.03.19(71)申请人兰州大学地址730000甘肃省兰州市城关区天水南路222号兰州大学(72)发明人岳修乐隋孟君安黎哲赵智星(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/20(2018.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，所述的制备方法主要包括以下步骤：(1)载体构建和农杆菌转化，(2)农杆菌介导的压力侵染，(3)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选，(4)GUS染色鉴定及后期培养。与普通转化方法相比，在转化过程中施加外源压力能够显著提高农杆菌介导的转基因的效率。该方法具有操作简便、转化效率高、稳定性好以及重复性强等特点。CN109880847ACN109880847A权利要求书1/1页1.一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的转基因植株的制备方法包括以下步骤：(1)载体构建；(2)农杆菌转化；(3)农杆菌介导压力侵染，所述的浸染是在施加外源压力条件下进行的；(4)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选；(5)β-D-葡萄糖苷酸酶基因染色鉴定及后期培养。2.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)的侵染环境的压力范围是2.55×105～2.64×105Pa。3.如权利要求2所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的侵染环境的压力为2.60×105Pa。4.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)的压力侵染是通过注射器完成的，操作步骤如下：将高山离子芥愈伤组织用无菌镊子碾碎，放入注射器中，用注射器中吸入10ml步骤(2)中的菌悬液，上下颠倒使愈伤组织全部浸入农杆菌重悬液中放置4min；拔掉注射器针头，堵住注射器的头部端口，持续施压3min；松开注射器头部的端口，继续侵染3min，压力侵染结束。5.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将转化完成的农杆菌加入MS液体重悬液进行稀释，并在稀释液中加入乙酰丁香酮备用。6.如权利要求5所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入乙酰丁香酮浓度为0-150μM。7.如权利要求6所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入乙酰丁香酮浓度为50μM。8.如权利要求6或7所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中农杆菌稀释液的浓度范围为OD＝0.4-0.8。9.如权利要求8所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中农杆菌稀释液的浓度为6.4×108cells/ml(OD＝0.8)。2CN109880847A说明书1/4页一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法。背景技术[0002]高山离子芥(Chorisporabungeana)是一种十字花科的高山冰缘植物，主要生长在海拔3600～3900m的乌鲁木齐河源区流石碓地区，该地区昼夜温差极大，并且年平均温度在-5～-7℃之间，6～8月平均气温仅为3.6℃，是一种伴随反复冻融现象的冰冻环境，因此高山离子芥是一种研究植物抗冻机制的特色冰缘植物，但是由于高山离子芥的转化体系尚不成熟，传统转化方法效率低且不稳定，这严重限制了对其抗逆基因的挖掘和功能的研究，也影响着抗逆基因在农牧业上的应用。对于其转基因方法的改进，可为研究包括高山离子芥在内的高山冰缘植物提供新的技术支持，具有良好的应用前景。[0003]随着植物基因工程的迅速发展，转化方法也在不断的完善，为后期广泛深入的研究提供了实验基础。目前将外源基因导入受体细胞的方法主要包括农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、组织电击法、PEG法等。其中以农杆菌介导的遗传转化方法应用最为广泛。农杆菌中含有Ti质粒，Ti质粒的T-DNA区能够向植物中转移并且整合到植物的基因组中。常用的几种植物实验材料包括烟草、拟南芥等都是通过将植物组织材料浸入农杆菌重悬液这种方法进行转化；花生、高粱等物种利用超声波法辅助农杆菌介导的转基因；非洲菊、棉花等物种通过真空渗透法提高农杆菌介导的转化效率。对于高山离子芥也有相关的探索实验，但是转化效率低且不稳定，并且没有相关实验证明转化后的基因能够在植株中稳定表达。