一种绵羊原代肝细胞分离培养方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114752549A(43)申请公布日2022.07.15(21)申请号202210510142.7(22)申请日2022.05.11(71)申请人中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所地址730050甘肃省兰州市七里河区小西湖硷沟沿335号(72)发明人卢曾奎陈博雯窦晓宁李建烨岳耀敬袁超郭婷婷刘建斌杨博辉(74)专利代理机构北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)11732专利代理师周新楣(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书8页附图3页(54)发明名称一种绵羊原代肝细胞分离培养方法(57)摘要本发明属于动物细胞培养技术领域，本发明提供了一种绵羊原代肝细胞分离培养方法。本发明方法包括采用直接破碎法或酶消化法对绵羔羊肝脏组织进行处理，得肝细胞悬液；将上述所得肝细胞悬液离心后弃上清，得沉淀a；将上述所得沉淀a与红细胞裂解液混合，静置后离心弃上清，得沉淀b；将上述所得沉淀b与完全培养基混合，置于鼠尾胶原包被的6孔板中培养，得肝细胞培养物；弃去上述所得肝细胞培养物中的未贴壁肝细胞和死细胞，将剩余的贴壁细胞与完全培养基混合进行培养等步骤。本发明方法制备得到的绵羊原代肝细胞增殖稳定，形态特征典型，具有传代和增殖能力。CN114752549ACN114752549A权利要求书1/1页1.一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将绵羔羊肝脏组织置于含1～3wt％PS的生理盐水中浸泡后，使用含0.5～1.5wt％PS的PBS缓冲液清洗，得绵羔羊肝脏组织a；(2)采用直接破碎法或酶消化法对上述所得绵羔羊肝脏组织a进行处理，得肝细胞悬液；(3)将上述所得肝细胞悬液离心后弃上清，得沉淀a；(4)将上述所得沉淀a与红细胞裂解液混合，静置后离心弃上清，得沉淀b；(5)将上述所得沉淀b与1～3mL完全培养基混合后置于鼠尾胶原包被的6孔板中培养，得肝细胞培养物；(6)弃去上述所得肝细胞培养物中的未贴壁肝细胞和死细胞，将剩余的贴壁细胞与1～3mL完全培养基混合进行培养，得绵羊原代肝细胞。2.根据权利要求1所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述绵羔羊肝脏组织与生理盐水的用量比为1g:4～6mL，所述清洗的次数为2～4次。3.根据权利要求1或2所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述直接破碎法包括如下步骤：将绵羔羊肝脏组织a破碎成0.5～1.5mm3的组织块，将组织块与完全培养基吹打混匀，使用细胞筛过滤较大组织块和杂质，收集滤液；所述完全培养基以William'sMediumE为基础培养基，包括以下浓度的组分：10～20vt％FBS和1～3mM谷氨酰胺；所述细胞筛的孔径为90～110μm。4.根据权利要求3所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶消化法采用酶的种类为Ⅳ型胶原酶和/或胰蛋白酶；当采用Ⅳ型胶原酶时，所述Ⅳ型胶原酶的浓度为0.5～1.5mg/mL或0.05～0.15mg/mL，所述Ⅳ型胶原酶的酶解温度为36～38℃，酶解时间为10～20min；当采用Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶时，所述Ⅳ型胶原酶的浓度为0.05～0.15mg/mL，所述胰蛋白酶的浓度为0.2～0.3wt％，所述Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶的体积比为1～2:1～2，所述Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶的酶解温度为36～38℃，酶解时间为10～20min。5.根据权利要求4所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心的转速为700～900rpm，所述离心的时间为4～6min。6.根据权利要求5所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述沉淀a与红细胞裂解液的用量比为1g:2～4mL，所述静置的温度为24～26℃，所述静置的时间为8～12min，所述离心的转速为700～900rpm，所述离心的时间为4～6min。7.根据权利要求6所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所5述沉淀b中的细胞个数为0.8～1.2×10个，所述培养过程中CO2的浓度为4～6％，所述培养的温度为36～38℃，所述培养的时间为12～36h。8.根据权利要求7所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(6)中所述培养的温度为36～38℃，所述培养的时间为3～5d。9.根据权利要求8所述的一种绵羊原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(6)中所述完全培养基独立以William'sMediumE为基础培养基，包括以下浓度的组分：10～20vt％FBS和1～3mM谷氨酰胺。2CN114752549A说明书1/8页一种绵羊原代肝细胞分离培养方法技术领域[0001