一种创伤弧菌灭活疫苗及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113694192A(43)申请公布日2021.11.26(21)申请号202110961269.6C12R1/63(2006.01)(22)申请日2021.08.20(71)申请人青岛农业大学地址266109山东省青岛市城阳区长城路700号(72)发明人张敏顾勤勤王光花郝东方刘红梅(74)专利代理机构北京云嘉湃富知识产权代理有限公司11678代理人阮文(51)Int.Cl.A61K39/106(2006.01)A61P31/04(2006.01)C12N1/20(2006.01)C12N1/36(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表5页附图4页(54)发明名称一种创伤弧菌灭活疫苗及其制备方法和用途(57)摘要本发明提供了一种创伤弧菌灭活疫苗的制备方法，包括：1)将TC38抗菌肽加入到创伤弧菌菌液中，进行灭活处理，得到灭活的创伤弧菌孵育液；2)将所述灭活的创伤弧菌孵育液离心，收集菌体沉淀，得灭活菌体；3)将所述灭活菌体以无菌PBS清洗数次后，分散于无菌PBS中，即得灭活疫苗。本发明还提供了相应的灭活疫苗及其应用。本发明以TC38抗菌肽灭活创伤弧菌得到了一种新型灭活疫苗，该疫苗在大菱鲆中诱发的相对免疫保护率显著高于福尔马林灭活疫苗组，可诱导鱼体产生更高的非特异和特异性免疫应答水平，在水产动物创伤弧菌病害防治中具有良好的应用前景。CN113694192ACN113694192A权利要求书1/1页1.一种创伤弧菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括：1)将TC38抗菌肽加入到创伤弧菌菌液中，进行灭活处理，得到灭活的创伤弧菌孵育液；2)将所述灭活的创伤弧菌孵育液离心，收集菌体沉淀，得灭活菌体；3)将所述灭活菌体以无菌PBS清洗数次后，分散于无菌PBS中，即得灭活疫苗。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：4)对灭活菌体进行无菌检验；优选地，所述无菌检验是通过包括下述步骤的方法实现的：将所述灭活菌体以无菌PBS稀释后，取适量涂布于固体培养基，28℃培养24～48h，以确认创伤弧菌是否灭活完全。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述创伤弧菌菌液是通过包括下述步骤的方法制备得到的：将于‑80℃保存的创伤弧菌以液体LB培养基复苏至对数生长中期，然后经离心、清洗后重悬于无菌PBS中，即得；优选地，重悬后得到的创伤弧菌菌液浓度为2×108CFU/mL。4.如权利要求1‑3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述TC38抗菌肽为氨基酸序列与SEQIDNO:1的同源性不低于85％的多肽。5.根据权利要求1‑4中任一项所述的制备方法制备得到的创伤弧菌灭活疫苗。6.一种用于预防或治疗海洋养殖动物创伤弧菌感染的药物，其特征在于，包含如权利要求5所述的创伤弧菌灭活疫苗；优选地，有效量为0.182mg/条。7.如权利要求5所述的创伤弧菌灭活疫苗在制备用于预防或治疗海洋养殖动物创伤弧菌感染的药物中的应用。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述海洋养殖动物选自鳗鲡、石斑鱼、鲟鱼、罗非鱼、金鲳鱼或大菱鲆中的一种或多种。2CN113694192A说明书1/9页一种创伤弧菌灭活疫苗及其制备方法和用途技术领域[0001]本发明涉及动物医学技术领域，具体涉及一种创伤弧菌灭活疫苗及其制备方法和用途。背景技术[0002]创伤弧菌作为人和海洋生物共患病的弧菌，它主要有三种类型：生物I型，它易导致摄入性病例和伤口感染；生物II型，是造成海洋养殖动物患病的致病类型；以及能够感染人类的生物Ⅲ型(吴后波和潘金培，2001；Bisharatetal.,1999；KellyandMcCormick,1981；Tisonetal.,1982)。创伤弧菌的致病性是多种致病因子共同作用的结果，主要包括溶血素、MARTX毒素、铁载体、荚膜多糖、脂多糖以及金属蛋白酶等(王青柏，2018；LiandWang,2020)。感染创伤弧菌后，易造成鳗鲡(FouzandAmaro,2003)、石斑鱼(Abdullahetal.,2017)、鲟鱼(Sietal.,2010)、罗非鱼(Chenetal.,2010)和金鲳鱼(Lietal.,2006)等经济动物大批量死亡。针对弧菌引起的疾病大多数采取抗生素进行治疗，有研究发现从病害动物分离出的弧菌对多种抗生素检测出耐药基因和耐药性(Kashulinetal.,2017；Letchumananetal.,2015)。随着水产疫苗研发工作的不断开展，疫苗在水产养殖病害中的应用越来越广泛。传统灭活疫苗使用福尔马林作为灭活剂，但灭活时完整抗原成分会遭到破坏，存在免疫效果不理想、免疫持续时间短的缺点(Sunetal.,2020)。弧菌的细胞外和表面蛋白质易于被