分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114277001A(43)申请公布日2022.04.05(21)申请号202111618861.2G01N33/577(2006.01)(22)申请日2021.12.28G01N33/558(2006.01)G01N33/58(2006.01)(83)生物保藏信息G01N33/548(2006.01)CGMCCNo.223472021.05.24G01N33/68(2006.01)(71)申请人福建农林大学B22F9/24(2006.01)地址350002福建省福州市仓山区上下店B22F1/054(2022.01)路15号B82Y30/00(2011.01)(72)发明人王荣智唐恒坤刘海梅汪世华高烨宏陈睿杨敏仪凌素美(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人林文弘蔡学俊(51)Int.Cl.C12N5/20(2006.01)权利要求书2页说明书14页C07K16/18(2006.01)序列表2页附图9页(54)发明名称分泌抗α-芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用(57)摘要本发明具体涉及一株能分泌抗α‑芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株5E4及其应用。该杂交瘤细胞株分类命名为抗α‑芋螺毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2020年5月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.22347。该杂交瘤细胞株5E4分泌的抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体特异性强、亲和力大、效价高，可应用于芋螺毒素的检测技术领域。基于该杂交瘤细胞株5E4及其所分泌的单克隆抗体，本发明建立了一种免疫侧流层析检测卡，该检测卡可应用于芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX检测中，且具有灵敏度高、检测快速的优势。CN114277001ACN114277001A权利要求书1/2页1.一株杂交瘤细胞株5E4，其特征在于：其分类命名为抗α‑芋螺毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年05月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.22347。2.一种抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体，其特征在于：其亚型为IgG2b，其由保藏编号为CGMCCNo.22347的杂交瘤细胞株5E4分泌产生。3.一种芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX的免疫侧流层析检测卡，其特征在于：所述检测卡包括样品垫、金标垫、检测膜、吸水垫和塑料卡壳；所述检测膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG2b抗体，所述检测线上包被有TRX‑αB‑CTX融合蛋白抗原；所述金标垫上含有胶体金或纳米花标记的抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体。4.一种如权利要求3所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）抗体及抗原的制备选用杂交瘤细胞株5E4分泌产生的抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体作为标记抗体，选用TRX‑αB‑CTX融合蛋白抗原作为检测线包被抗原，选用羊抗小鼠IgG2b抗体作为质控线包被抗体；2）检测膜的制备将1.6mg/mL的检测线包被抗原和1mg/mL的质控线包被抗体用0.01MpH7.4的PBS缓冲液分别按1/0.5和1/1进行稀释，将二者以0.5cm的间隔在硝酸纤维膜上划线，划线量为2μL/cm，得到检测线和质控线，干燥备用；3）样品垫的制备将玻纤GL‑b02样品垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；4）金标垫的制备将聚酯MA0280金标垫剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥；将胶体金或纳米花标记的抗芋螺毒素αB‑VxXXIVA‑CTX单克隆抗体溶液以4μL的量点涂于金标垫上，干燥备用；5）吸水垫的制备将吸水纸剪裁成长20mm宽4mm的长条，放入封闭液中浸泡1小时后，取出，干燥备用；6)检测卡的组装在DB‑6卡式底板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm，得到试纸条；将组装好的试纸条裁切成宽0.3cm长6cm的小条，置于塑料卡壳的卡槽内，盖上上盖，压紧，即得到所述免疫侧流层析检测卡；其中，所述封闭液配方按质量分数计为：0.01MpH7.4PBS缓冲液+1%牛血清白蛋白+0.5%PEG20000+0.5%吐温20。5.根据权利要求4所述的免疫侧流层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述胶体金的制备方法为：将1gHAuCl4溶于100mLddH2O中，得到1wt%的氯金酸水溶液，然后按1mL/管平均分装于1.5mL无菌的EP管中，用锡箔纸密封后置于‑20℃冰箱中保存备用；取1mL1wt