表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114292824A(43)申请公布日2022.04.08(21)申请号202210018673.4(51)Int.Cl.(22)申请日2022.01.08C12N7/01(2006.01)C12N7/04(2006.01)(83)生物保藏信息C12N15/45(2006.01)CGMCCNO.450592021.12.13C12N15/56(2006.01)CGMCCNO.450602021.12.13C12N15/40(2006.01)CGMCCNO.450582021.12.13C12N15/86(2006.01)(71)申请人河南农业大学A61K39/295(2006.01)地址450002河南省郑州市金水区农业路A61K39/17(2006.01)63号A61K39/12(2006.01)(72)发明人赵军乔麒龙黄庆杨盼盼A61P31/14(2006.01)王白玉王增李永涛(74)专利代理机构郑州大通专利商标代理有限公司41111代理人高为宝权利要求书2页说明书12页序列表8页附图8页(54)发明名称表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用(57)摘要本发明属于动物基因工程疫苗领域，具体涉及表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用，具体是：将鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因共有序列插入到含有基因VII型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株中，得到即为表达鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒；所述嵌合型LaSota弱毒株是用基因VII型NDV的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸序列突变的F基因分别替换LaSota疫苗株的HN和F基因后得到的。本发明可作为多联疫苗制备用种毒为研发有效防控IBDV变异株和基因VII型NDV感染的廉价高效疫苗奠定基础。CN114292824ACN114292824A权利要求书1/2页1.表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，将鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因共有序列插入到含有基因VII型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株中，得到即为表达鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒；所述嵌合型LaSota弱毒株是用基因VII型NDV的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸序列突变的F基因分别替换LaSota疫苗株的HN和F基因后得到的。2.根据权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，所述嵌合型LaSota弱毒株是以带有LaSota全基因组cDNA的载体为骨架，在大肠杆菌中利用同源重组技术和反向筛选标记系统，将LaSota疫苗株的HN和F基因分别替换为基因VII型NDV流行株的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸优化突变后的基因VII型F基因，得到重组的转录质粒；然后将转录质粒和表达NDVLaSota疫苗株核蛋白、磷酸蛋白和大聚合酶蛋白的辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，进而得到重组LaSota疫苗株；优化突变后的基因VII型F基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，所述基因VII型NDV流行株的HN基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建LaSota株的感染性克隆质粒；（2）分别构建含有VII型NDV流行毒株的HN基因和优化突变后的F基因的重组载体；其中基因VII型NDV流行株的F基因中的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112RRQKR↓F117突变为112GRQGR↓L117；（3）利用带有LaSota株的F和HN基因两侧同源序列的引物，以步骤（2）中制备的重组载体、含有抗性筛选标记以及大肠杆菌自杀基因的重组质粒为模板，分别扩增优化突变后的基因VII型NDV的F基因和HN基因，以及抗性筛选标记和大肠杆菌自杀基因的筛选表达盒；（4）将带有LaSota株F基因两侧同源臂的筛选表达盒与LaSota的感染性克隆质粒共转化进宿主菌，筛选阳性克隆，得到重组质粒pLaSota‑ΔF‑筛选表达盒；（5）利用Redαβ重组酶介导的同源重组技术，将pLaSota‑ΔF‑筛选表达盒中的筛选表达盒替换为优化突变后的基因VII型NDV的F基因，得到重组质粒pLaSota‑7F；（6）利用带有LaSota株HN基因两侧同源臂的引物扩增的筛选表达盒片段与重组质粒pLaSota‑7F共转化进宿