基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114480679A(43)申请公布日2022.05.13(21)申请号202111588265.4C12N15/11(2006.01)(22)申请日2021.12.23C12R1/42(2006.01)C12R1/92(2006.01)(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人王佳邵彦春李俊杰丁一峰黄晨曦王小红张静(74)专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司42104专利代理师冯超刘琳(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12Q1/70(2006.01)C12Q1/10(2006.01)权利要求书2页说明书11页附图2页(54)发明名称基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法(57)摘要本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法，所述试剂盒包括含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液，以及实时荧光定量PCR(qPCR)检测的引物对；噬菌体生物扩增联合qPCR方法对食品基质中的沙门氏菌的最低检出限为10CFU/mL，检测时间仅为3.5h，且能区分活菌和死菌。本发明为快速检测食品中沙门氏菌的污染提供了理论依据。CN114480679ACN114480679A权利要求书1/2页1.一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对STp：正向引物STp‑F：5′‑CACTCAGCCGCACTATCAAT‑3′，反向引物STp‑R：5′‑TCATCGCACTAACCGTAAGC‑3′。2.根据权利要求1所述快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括氯化钙溶液、阴性对照品、阳性对照品；其中，氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，阳性对照品为鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311。3.一种利用权利要求1所述试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)噬菌体生物扩增法检测a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液与待检测的样品混合，再加入氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物A；b.将上述培养物A置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物B；2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：a.分别取上述培养物A和培养物B提取噬菌体DNA，并保存于‑20℃；b.以噬菌体的DNA为模板，利用引物对STp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对STp为：正向引物STp‑F：5′‑CACTCAGCCGCACTATCAAT‑3′，反向引物STp‑R：5′‑TCATCGCACTAACCGTAAGC‑3′；c.根据两个PCR产物的Ct值的差值ΔCt定性判断样品中是否存在有活性的鼠伤寒沙门氏菌，判断依据为：当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌；d.以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，制作标准曲线，定量分析食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度。4.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，沙门氏菌噬菌体T156悬液与前处理样品按体积1:1混合，再加入同等体积的氯化钙溶液，其工作浓度为20mmol/L，且沙门氏菌噬菌体T156悬液的浓度为105PFU/mL。5.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第b小步中，培养物A置于37℃恒温摇床中振荡培养，培养时间为60min。6.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第a小步中，将培养物A和培养物B用热裂解的方式提取DNA作为模板，即提取噬菌体与宿主菌混合培养前后样品中的DNA作为模板。7.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第b小步中，PCR的反应体系如下：2CN114480679A权利要求书2/2页3CN114480679A说明书1/11页基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法技术领域[0001]本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法。背景技术[0002]沙门氏菌(Salmonellaspp.)是引起食源性疾病的最常见的食源性致病菌之一，其感染人类造成的沙门氏菌病表现为呕吐、腹泻、发烧等症状，甚至导致死亡。研究表明，沙门氏菌主要通过食物感染人类，易污染肉、蛋、牛奶、水果、和蔬菜等食物。候海燕等人在2010‑2016年间对江苏省淮安市的262份生牛肉样