一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114642725A(43)申请公布日2022.06.21(21)申请号202011510586.8C07K14/01(2006.01)(22)申请日2020.12.19C07K1/34(2006.01)(71)申请人江西正邦科技股份有限公司地址330096江西省南昌市高新技术开发区艾溪湖一路569号申请人江西正邦农业科学院(72)发明人林峰肖敏王闯王睿卢昌尹航(74)专利代理机构南昌华成联合知识产权代理事务所(普通合伙)36126专利代理师黄晶(51)Int.Cl.A61K39/295(2006.01)A61K39/12(2006.01)A61P31/20(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法(57)摘要本发明公开了一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，包括以下几个步骤：S1‑S3、利用宿主细胞培养猪圆环病毒2a型/2b型病毒毒株，S4‑S7、继续培养病毒,将所得病毒液于‑20℃反复冻融三次,并通过离心机离心10分钟，然后对其杀菌静置，再经中空纤维膜过滤，得到半成品病毒液，通过PBS缓冲液对半成品病毒液进行洗涤，并通过超滤中空纤维膜浓缩纯化，再次浓缩并收集浓缩液，最终获得猪圆环病毒2a型/2b型纯化浓缩病毒液；S8‑S9、测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，并与免疫佐剂混合乳化，制得猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗。本发明中病毒灭活剂使用量降低为传统工艺的20％，灭活过程中控制pH值减少有效蛋白析出，两项技术结合有效降低疫苗生产成本。CN114642725ACN114642725A权利要求书1/2页1.一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将制苗用宿主细胞分别接种到两组含有生长用培养液与微载体的载体罐内,并将上述细胞与微载体混合均匀,使细胞贴附在微载体上；在适宜培养条件下,提供上述细胞生长足够的养分及气体环境,使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的10～50倍；S2、分别向两个载体罐内加入猪圆环病毒2a型毒株以及猪圆环病毒2b型种毒株,并使其接种在细胞上,然后静置培养24小时后将细胞维持液弃去,将接种病毒的细胞以0.01mol/L、pH7.2的的PBS缓冲液充分洗涤,加入D‑氨基葡萄糖培育30min；S3、弃去D‑氨基葡萄糖,将细胞以0.01mol/L、pH为7.2的PBS充分洗涤,加入细胞维持液继续培养细胞；S4、连续培养7～10天后,将所得病毒液于‑20℃反复冻融三次,并通过离心机8000r/min离心10分钟，取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，静置12h并在4℃室温下过7夜，经中空纤维膜过滤，得到半成品猪圆环病毒2a型/2b型病毒液，病毒含量≥10TCID50/ml；S5、所述半成品猪圆环病毒2a型/2b型病毒液经微孔过滤器过滤，收集滤液，并向滤液加入1/3～2/3倍体积量的0.015mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，再次澄清过滤，收集洗液，混合所述滤液和所述洗液，得到澄清过滤后的病毒液；S6、向步骤S5中澄清过滤后的病毒液加入0.1％所得病毒液体积的灭活剂，搅拌灭活24～48小时，灭活过程中控制灭活体系pH稳定控制在7.0～7.4之间；S7、将步骤S6中的所得灭活的猪圆环病毒2a型/2b型病毒液补加0.015mol/L、pH7.2的PBS缓冲液进行洗涤，经100KD～1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，再次浓缩并收集浓缩液，最终获得原病毒液体积的1/10～1/5的猪圆环病毒2a型/2b型纯化浓缩病毒液；S8、测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2PBS缓冲液进行稀释，使Cap蛋白含量定量于25～80μg/ml；S9、将上述两种抗原液按照1:1等体积比例混合后接着与免疫佐剂混合乳化，制得猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗。2.根据权利要求1所述一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中的所述培养条件具体为：温度为37℃，气体环境下含5％的CO2，细胞生长液为含5％血清的DMEM，其pH值为7.2。3.根据权利要求1所述一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述细胞维持液为含1％～3％血清的DMEM，pH为6.8～7.2。4.根据权利要求1所述一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S5中所述微滤中空纤维膜的孔径为0.45μm或0.65μm。5.根据权利要求1所述一种猪圆环病毒2a型/2b型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S7中所述超滤中空纤维膜的孔径为100KD或300KD。6.根据权利要求1所述一