蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114672498A(43)申请公布日2022.06.28(21)申请号202210545765.8C12N15/66(2006.01)(22)申请日2022.05.19C12N15/82(2006.01)A01H5/02(2018.01)(71)申请人中国热带农业科学院热带作物品种A01H6/20(2018.01)资源研究所C12R1/19(2006.01)地址570000海南省海口市龙华区学院路4号(72)发明人徐立荆永琳王小冰李志英杨庆全(74)专利代理机构海口翔翔专利事务有限公司46001专利代理师张耀婷(51)Int.Cl.C12N15/29(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页(54)发明名称蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用(57)摘要本发明公开蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfCAL基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans‑T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因的cDNA全长1315bp，编码含253个氨基酸残基的蛋白质。利用实时荧光定量PCR测定了蜻蜓凤梨不同组织器官AfCAL基因的表达水平，AfCAL在蜻蜓凤梨中的表达量较高，说明蜻蜓凤梨AfCAL基因具有调控植物开花的功能。AfCAL基因的获得，为研究蜻蜓凤梨开花机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。CN114672498ACN114672498A权利要求书1/2页1.一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以蜻蜓凤梨为材料，利用CTAB法提取总RNA；(2)AfCAL基因的克隆；(2‑1)利用Transgene公司的‑UniOne‑StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixKit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；(2‑2)设计全长cDNA扩增引物；(2‑3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：(1‑1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶；(1‑2)取850μlCTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热；(1‑3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1‑2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ‑巯基乙醇；(1‑4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min；(1‑5)加入等体积氯仿/异戊醇，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1‑6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1‑7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/lLiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10‑12h，不要超过16h；(1‑8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇500μl洗涤沉淀两次，弃去液体，风干；(1‑9)加入30‑40μlRNase‑free水溶解沉淀；(1‑10)取2μlRNA样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μlRNA样品用SimpliNano微量分光光度计测定样品的浓度与纯度，剩余RNA样品于‑80℃保存备用，保存时间不要超过一周。4.根据权利要求2所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，其特征在于，步骤(2‑2)中的扩增引物包括的序列AfCAL‑F和AfCAL‑R，序列分别如序列表中的SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。5.一种蜻蜓凤梨AfCAL基因表达载体，其特征在于：利用了权利要求1所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因为目的基因的表达载体。6.根据权利要求5所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因插入到植物表达载体CaMV35S‑gfp上，构建成在CaMV35S启动子下游含有蜻蜓凤梨AfCAL基因的高效表达载体。2CN114672498A权利要求书2/2页7.根据权利要求6所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因表达载体，其特征在于：根