一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114774583A(43)申请公布日2022.07.22(21)申请号202210258063.1C12R1/93(2006.01)(22)申请日2022.03.16(71)申请人新疆农业大学地址830052新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区南昌路42号(72)发明人史慧君付强李丹马雪连姚刚杨莉陈俊贞李泽宇贺渊秀董文丽(74)专利代理机构西安鼎迈知识产权代理事务所(普通合伙)61263专利代理师刘喜保(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用(57)摘要本发明提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，针对BCoV和BRV基因序列发明了特异性引物和探针，并且可以同时检测BCoV和BRV；所述试剂盒具有高灵敏度，能够直接定量，自动分析出结果，不依赖Ct值，不用建立标准曲线；快速高效、操作简便、重复性好的优点，可以对低丰度的目的基因进行检测的特点，通过临床试验对比现有的qPCR检测，BCoV检出阳性样本9个，阳性率为10.98％；BRV检出阳性样本10个，阳性率为12.2％。而采用本申请提供试剂盒检出BCoV阳性样本15个，阳性率为18.29％；BRV检出阳性样本12个，阳性率为14.63％；BCoV和BRV混合感染检出阳性样本5个，阳性率为6.1％。通过应本申请提供的检测试剂盒，为有效防控BCoV和BRV提供技术支持，对于养牛业具有巨大的潜在开发价值。CN114774583ACN114774583A权利要求书1/1页1.一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性引物和探针组合，包括以下2对特异性引物和2条特异探针，其核苷酸序列分别为：BCOV上游引物：5’‑GATCTACTTCACGCGCATCC‑3’，BCOV下游引物：5’‑GTGGCTTAGTGGCATCCTTG‑3’，BCOV探针：5’‑FAM‑TGGCTCTACTGCGCGATCCTGCA‑BHQ1‑3’；BRV上游引物：5’‑CAATGTGGCTGAATGCAGGA‑3’，BRV下游引物：5’‑GCGGTAGTCAACACTCTTCG‑3’，BRV探针：5’‑HEX‑TGCGCTATCAACGCACCAGCT‑BHQ1‑3’。2.如权利要求1中所述的一种用于同时检测BCoV和BRV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(1)如权利要求1中所述的两套引物和探针；(2)2×ddPCRSuperMixforProbes；(3)RNase‑FreeddH2O；(4)待检测样品的cDNA；(5)微滴生成油；(6)微滴发生卡；(7)微滴发生卡密封胶垫；(8)96孔PCR反应板；(9)热封箔膜。3.如权利要求1所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、提取待检样品的总RNA，反转录为cDNA；(2)、配置ddPCR反应体系，并加入待检样品的cDNA；(3)、微滴的生成；(4)、微滴PCR扩增反应；(5)、反应结束后，机器读取荧光信号，自动计算目的基因含量；样品检测结果≥1copies/μL判断为阳性，样品检测结果＜1copies/μL判断为阴性。4.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述双重ddPCR反应总体系为20μL，其中包括：(1)2×ddPCRSuperMixforProbes10μL；(2)两套上、下游引物分别加450nM；(3)两种探针分别加250nM；(4)待检cDNA模板2μL；(5)RNase‑FreeddH2O补足至20μL。5.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述微滴PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环；98℃10min；4℃终止反应，升降温速率2℃/s。6.如权利要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒在同时检测BCoV和BRV中的应用。7.如权利要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV试剂盒的使用方法在同时检测BCoV和BRV中的应用。2CN114774583A说明书1/8页一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测试剂盒的技术领域，更具体的涉及一种同时检测牛冠状病毒和牛轮状病毒的试剂盒与应用的技术领域。技术背景[0002]牛冠状病毒，BCoV属于冠状毒科(Coronaviridae