猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114908065A(43)申请公布日2022.08.16(21)申请号202210492200.8A61K39/245(2006.01)(22)申请日2022.05.07A61P31/22(2006.01)C12R1/93(2006.01)(71)申请人中国农业大学地址100083北京市海淀区清华东路17号(72)发明人韩军杨汉春任建乐盖新娜周磊郭鑫高鹏(74)专利代理机构北京兴智翔达知识产权代理有限公司11768专利代理师郭卫芹(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)C12N7/04(2006.01)C12N15/38(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N15/113(2010.01)权利要求书2页说明书17页序列表11页附图9页(54)发明名称猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用(57)摘要本发明公开了猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建得到猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，即以猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗毒株Bartha‑K61为骨架包含变异毒株HB1201免疫保护基因gB、gC、gD的嵌合病毒，命名Bartha‑gBCDHB1201。该弱毒疫苗株遗传性质稳定，复制效率高且安全性好，同时能刺激机体产生针对国内流行的变异毒株的中和抗体，Bartha‑gBCDHB1201疫苗株能更好的阻止感染仔猪发病、降低组织病毒载量和减轻病毒感染造成的脏器损伤，提供100％完全免疫保护，适用于弱毒活疫苗与灭活疫苗的制备和使用。CN114908065ACN114908065A权利要求书1/2页1.一种猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以PRV疫苗毒株Bartha‑K61为骨架，利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha‑K61的基因组第53203～54617位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gC基因，得到嵌合病毒Bartha‑gCHB1201，所述gC基因为HB1201基因组第52665～54100位核苷酸；(2)利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha‑K61的基因组第119529～120650位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gD基因，得到嵌合病毒Bartha‑gCDHB1201，所述gD基因为HB1201基因组第114954～116081位核苷酸，所述gD基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域设置序列同义突变遗传标记；(3)利用CRISPR/Cas9系统，将Bartha‑K61的基因组第16575～18803位核苷酸替换为变异毒株HB1201基因组的gB基因，得到嵌合病毒Bartha‑gBCDHB1201，所述gB基因为HB1201基因组第15760～17982位核苷酸，所述gB基因在CRISPR/Cas9系统的编辑区域设置序列同义突变遗传标记。2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的建立方法，其特征在于，步骤(1)包括：A、序列分析PRV疫苗毒株Bartha‑K61与变异毒株HB1201基因组的gC基因，利用CRISPR/Cas9系统，在gC基因变异区域两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述双链sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335‑left‑gC和pX335‑right‑gC；B、以疫苗毒株Bartha‑K61为模板，PCR扩增得到gC基因编辑区域两端的同源臂Bartha‑gC‑left‑arm和Bartha‑gC‑right‑arm；C、以pEGFP‑N2为模板PCR扩增GFP基因，将扩增后的GFP基因分别与Bartha‑gC‑left‑arm和Bartha‑gC‑right‑arm进行融合，得到融合产物GFP‑donor，将GFP‑donor克隆到pEASY‑Blunt载体上，测序，GFP‑donor测序正确后，PCR扩增，得到线性GFP‑donor；D、将疫苗毒株Bartha‑K61的基因组、线性GFP‑donor、pX335‑left‑gC和pX335‑right‑gC共转染VeroCCL81细胞，拯救并纯化嵌合病毒，得到嵌合病毒BarthaΔgC‑GFP；E、利用CRISPR/Cas9系统，在GFP基因两端设计sgRNA，并将两端设计sgRNA，经退火处理形成双链sgRNA并将所述sgRNA克隆至pX335质粒中，得到pX335‑left‑GFP和pX335‑right‑GFP；F、以变异毒株HB1201基因组为模板，PCR扩增所述gC基因，得到扩增产物gCHB1201，利用融合PCR，将gCHB1201分别与Bartha‑