一种几丁质复合酶及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115125227A(43)申请公布日2022.09.30(21)申请号202210560290.XC12P19/26(2006.01)(22)申请日2022.05.23(71)申请人中国农业科学院植物保护研究所地址100193北京市海淀区圆明园西路2号中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室申请人大连理工大学(72)发明人杨青屈明博张艾婧田爽刘田(74)专利代理机构北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙)11333专利代理师胡敬红(51)Int.Cl.C12N9/42(2006.01)C12P19/14(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种几丁质复合酶及其应用(57)摘要本发明涉及一种几丁质复合酶及其应用，所述几丁质酶复合酶为Chi‑h、ChtI和ChtII的混合酶，以固体几丁质为底物，采用本发明几丁质复合酶进行水解，添加总量为1μM，通过铁氰化钾法测定生产的氨基葡萄糖的量，通过计算能够在4小时实现底物超过75％的转化。本发明利用昆虫几丁质降解系统中多种酶的协同作用，实现几丁质短时间内的高效降解，生产氨基葡萄糖，本发明反应过程条件温和，易于产物的分离及反应过程的实现。CN115125227ACN115125227A权利要求书1/1页1.一种几丁质复合酶，由几丁质酶Chi‑h、ChtI和ChtII‑B4C1组成，其摩尔比为1：(0.5～3)：(0.5～3)。2.根据权利要求1所述的几丁质复合酶，所述几丁质酶Chi‑h、ChtI和ChtII‑B4C1的摩尔比为1：1～3：1～3。3.根据权利要求2所述的几丁质复合酶，所述几丁质酶Chi‑h、ChtI和ChtII‑B4C1的摩尔比为1：1：3。4.一种利用昆虫几丁质降解体系降解固体几丁质生产氨基葡萄糖的方法，以固体几丁质为底物，采用权利要求1‑3任一所述的几丁质复合酶进行降解，分离得到氨基葡萄糖。5.根据权利要求4所述的方法，所述底物悬浮于20mM、pH6.0‑7.0的缓冲液中，所述几丁质复合酶的总添加浓度为1μM，底物浓度为0.5‑2mg/mL，所述降解时长为4‑24小时。6.根据权利要求4所述的方法，所述固体几丁质为脱脂后的虾壳废弃物粉末，所述降解分为两步进行，先将底物采用蛋白酶进行预处理水解蛋白质，离心后收集沉淀，再采用几丁质复合酶酶解沉淀。7.根据权利要求6所述的方法，所述预处理为将底物悬浮于pH7.0‑8.0的缓冲液中，加入终浓度为100000U/g蛋白酶进行预处理水解，所述酶解为将预处理后分离得到的沉淀悬浮于20mM、pH6.0‑7.0的缓冲液中，加入几丁质复合酶酶解，所述几丁质复合酶的添加浓度为1μM。8.根据权利要求7所述的方法，所述预处理水解条件为温度20℃‑40℃，水解的时间为2～6小时，所述酶解条件为温度20℃‑40℃，酶解时长为4‑24小时。9.根据权利要求5或7所述的方法，所述pH7.0‑8.0，pH6.0‑7.0缓冲液为磷酸盐缓冲液或者醋酸铵缓冲液。10.根据权利要求4‑9任一所述的方法，所述的固体几丁质为结晶状态的固体颗粒状几丁质，粒度小于50目。2CN115125227A说明书1/4页一种几丁质复合酶及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种酶解反应，特别是涉及一种几丁质复合酶及其应用。背景技术[0002]几丁质是由N‑乙酰氨基葡萄糖通过β‑1,4糖苷键聚合而成的天然多糖，又名甲壳质或壳多糖。自然界中，几丁质是年产量最高的含氮多糖，约为100亿吨，主要存在于真菌细胞壁，虾、蟹等节肢动物的外骨骼以及昆虫的表皮中，是重要的生物质资源。其降解产物氨基糖类可广泛应用于食品、农业、医药等领域，具有重要的经济价值。[0003]目前，可以通过化学法或生物酶法降解几丁质，但常用的化学降解法消耗大量强酸强碱，对环境污染巨大，产品的成分复杂、质量差，采用生物酶法降解几丁质环境友好，污染少，符合绿色持续发展的要求。采用生物酶法降解几丁质的一个主要问题在于，天然条件下存在的几丁质多以致密的固态形式存在，其内部分子之间存在大量的氢键，使得采用单独的酶在降解几丁质时效率非常低，限制了几丁质为生物质资源的应用。自然界中以几丁质为碳源的微生物以及含有几丁质的生物如昆虫中均含有几丁质降解体系，包括多种不同种类的酶，例如裂解性几丁质单加氧酶(LPMO)，几丁质酶(Cht)以及β‑N乙酰己糖胺酶(Hex)。中国专利“一种利用昆虫几丁质酶降解几丁质生物N‑乙酰氨基葡萄糖的方法”(Zl2018100442700)公开了采用几丁质酶H和几丁质酶I作为混合酶对几丁质微丝进行酶解，几丁质酶H和几丁质酶I有协同作用，能实现晶态的几丁质的高效降解。然而固体几丁质必须经过破碎，变成几丁质微