一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115623986A(43)申请公布日2023.01.20(21)申请号202211323237.4(22)申请日2022.10.27(71)申请人天津农学院地址300392天津市西青区津静路22号(72)发明人董洪雨刘艳军许丁帆黄俊轩李建科武春霞梁兴(74)专利代理机构天津市杰盈专利代理有限公司12207专利代理师朱红星(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法(57)摘要本发明公开了一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法。包括：芹菜愈伤组织的准备、芹菜愈伤组织的染色、染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准、验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法等步骤。本发明公开的鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，在体细胞诱变育种、遗传转化和植物组织脱毒培养方面都有良好的应用前景，并存在较强的技术优势。CN115623986ACN115623986A权利要求书1/1页1.一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1‑2mm的小块放到载玻片上，滴2‑3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5‑10分钟；（2）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色，染色时间为10‑15分钟，染色温度为25‑28℃；（3）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；（4）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，在放大200‑400倍的条件下进行观察计数；判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500‑1000个，当被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数达到1‑2%时，就判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化；在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数‑核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100‑200个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，计算它们的比值；这一比值达到40‑60%时，就判断这些细胞处于完全胚性化状态；上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化；（5）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为25‑28℃，1000Lx连续光照，经过50‑60d后，到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出，经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，就判断此鉴别标准是可靠的。2.权利要求1所述鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法在提高芹菜愈伤组织胚性化再生效率上的应用。2CN115623986A说明书1/5页一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法技术领域[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，特别是一种涉及鉴别芹菜胚性愈伤组织完全胚性化的方法。背景技术[0002]芹菜（ApiumgraveolensL.）作为我国常见的蔬菜之一，种植历史悠久、地区广泛。芹菜在我国种植历史悠久、地区分布广泛，并且芹菜富含维生素和纤维素，对人体有益，近年来，逐渐成为我国餐桌上常见的蔬菜之一。植物的体细胞胚发生指离体的植物细胞或组织在适当的诱导条件下，通过与合子胚相似的途径，经过球形胚、鱼雷胚、心形胚和子叶胚四个阶段，形成胚状体从而发育成完整植株。诱导体细胞胚发生能够极大地发挥植物细胞的分化潜力，具有较高的遗传稳定性。然而只有愈伤组织完全胚性化，才能进行体细胞胚发生诱导出胚状体进而再生出完整植株。传统的判断愈伤组织是否胚性化的依据是通过观察细胞的形态结构特征来判断，一般根据细胞核大小和细胞的形态特征，这些都是以描述性的语言进行判断，在实际操作中无法依照量化的标准执行，因此导致愈伤组织胚性化程度不够，再生的植株数量少，质量差，无法满足试验的要求。虽然可以根据愈伤组织再生的情况进行判断，但往往要反复试验多次，浪费大量的时间和成本，而本方法采用显微镜检技术，通过显微观察计算细胞分裂频度和核占比来鉴定别愈伤组织是否完全胚性化，从而使得操作者能够精确判定芹菜愈伤组织是否完全胚性化，提高了试验效率，为进一步利用芹菜胚性愈伤组织研究与