一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115812596A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211458085.9(22)申请日2022.11.16(71)申请人云南农业大学地址650100云南省昆明市盘龙区金黑公路95号(72)发明人贺水莲杨正安杨扬李耕耘谢俊俊吴红芝孟静李雪娇赵雁张杰(74)专利代理机构重庆宏知亿知识产权代理事务所(特殊普通合伙)50260专利代理师梁山丹(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)A01H6/34(2018.01)权利要求书2页说明书4页附图1页(54)发明名称一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法(57)摘要本发明公开了一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，涉及胚性愈伤组织培养技术领域。步骤包括：S1、获取外植体；S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养；S3、初级愈伤组织的继代培养基，进行继代培养；S4、胚性愈伤组织的和培养。本发明通过步骤S1获取合适的外植体，并进行灭菌处理，然后将灭菌后的外植体放入初级愈伤组织培养基上进行初级愈伤组织的培养，获得初级愈伤组织后转入继代培养基进行继代培养，最后将经过多次继代培养的继代愈伤组织转入胚性愈伤组织培养基进行诱导、培养，获得大量的胚性愈伤组织，便于后期的转基因实验。CN115812596ACN115812596A权利要求书1/2页1.一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获取外植体，并进行处理后转入S2；S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入S3；S3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入S4；S4、胚性愈伤组织的和培养。2.根据权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S1中所采取的措施包括以下步骤：S11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；S12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台；S13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；S14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。3.根据权利要求2所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S13采取的措施包括以下步骤：S130、采用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟；S131、采用无菌水冲洗2‑3次；S132、采用2％的次氯酸钠消毒20分钟；S134、采用0.1％的升汞溶液消毒2分钟；S135、采用无菌水冲洗5‑8次。4.根据权利要求3所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S14中所采取的措施包括以下步骤：S140、剔除叶片上主脉和边缘部分；S141、将处理后的叶片剪成1cm×1cm大小的方块。5.根据权利要求4所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S2中采取的措施包括以下步骤：S21、采用含有30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；S22、所述步骤S21中加入10mg/L的维生素B1、1mg/L的维生素B6、1mg/L的甘氨酸、1mg/L的烟酸、100mg/L的肌醇、100mg/L的水解酪蛋白、400mg/L的麦芽提取物、以及4g/L的植物凝胶；S23、所述步骤S21中还需加入2mg/L的BA、1mg/L的NAA以及0‑6mg/L的TDZ；S24、采用暗培养，并控制培养温度在25±1℃，培养4‑5周。6.根据权利要求5所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S3所采取的措施包括以下步骤；S31、将步骤S2中得到的初级愈伤组织转移至继代培养基中，且所述继代培养基与初级愈伤组织培养基相同；S32、全天24h光照，光照强度控制在1500‑2000lx，控制温度在23±1℃。7.根据权利要求6所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S4所采取的措施包括以下步骤：S41、将继代培养后的愈伤组织转移至胚性愈伤组织培养基；2CN115812596A权利要求书2/2页S42、所述胚性愈伤组织培养基采用含有30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；S43、所述步骤S42中加入20mg/L的维生素B1、20mg/L的甘氨酸、40mg/L的半胱氨酸、200mg/L的肌醇、200mg/L的水解酪蛋白、800mg/L的麦芽提取物、60mg/L的硫酸腺嘌呤以及4g/L的植物凝胶；S44、所述步骤S43中还需加入1.5mg/L的BA、0.2mg/L的NAA以及0.5mg/L的TDZ；S45、采用12h光照，光照强度在1000‑2000lx之间，温度25℃的环境下进行。8.根据权利要求7所述的一种