一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115644064A(43)申请公布日2023.01.31(21)申请号202211438185.5(22)申请日2022.11.16(71)申请人中国热带农业科学院海口实验站地址570102海南省海口市龙华区城西镇学院路4号(72)发明人王悠常胜合舒海燕李科明詹儒林(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202专利代理师王美燕(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图1页(54)发明名称一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法(57)摘要本申请公开了一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法。筛选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织通过液体培养基悬浮培养，经过持续继代同时筛除大颗粒愈伤组织以建立菠萝胚性悬浮细胞系。所述菠萝胚性细胞悬浮系中，细胞形状及细胞团大小均一，细胞分散性好，细胞生长增殖迅速，可直接用于原生质体的分离、培养、杂交、基因转移和次生代谢物的生产等，作为遗传转化材料能有效避免嵌合体现象产生，大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。CN115644064ACN115644064A权利要求书1/2页1.一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取外植体，采用愈伤组织培养基进行培养，挑选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织作为悬浮细胞培养的材料，避免选择出现褐化、发白现象以及水样化的愈伤组织；(2)将颗粒状愈伤组织放入容器中夹碎，向容器中加入悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；(3)将培养后的悬浮培养物中的大颗粒愈伤组织筛除，静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；(4)筛除大颗粒愈伤组织，重复步骤(3)的操作，在恒温摇床上进行恒温振荡培养；(5)对悬浮培养物进行继代，同时定期取培养物进行显微观察，直至观察到的悬浮细胞呈大小均一的圆形或者椭圆形，为单细胞和小细胞团组成，无其他不规则形状的细胞和大细胞团，即完成菠萝胚性细胞悬浮系的建立。2.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(1)中挑选的愈伤组织为以冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽为外植体诱导5周至6周的愈伤组织。3.根据权利要求2所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，所述外植体为吸芽。4.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(1)中使用的愈伤组织培养基为：MS培养基中添加13μM/L6‑BA、1μM/LNAA和7g/L琼脂，pH＝5.8；愈伤组织培养条件为恒温28℃，暗培养。5.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基含有：氯化铵500～600mg/L、硝酸钾2000～3000mg/L、氯化钙400～500mg/L、七水硫酸镁300～400mg/L、磷酸二氢钾150～200mg/L、碘化钾0.5～1.0mg/L、硼酸6～7mg/L、硫酸锰22～26mg/L、硫酸锌1.5～2.0mg/L、钼酸钠0.2～0.3mg/L、硫酸铜0.02～0.03mg/L、氯化钴0.02～0.03mg/L、乙二胺四乙酸二钠35～40mg/L、硫酸亚铁25～30mg/L、谷氨酰胺1000～1200mg/L、干酪素水解物500～600mg/L、精氨酸100～150mg/L、甘氨酸1～3mg/L、盐酸硫胺素0.3～0.6mg/L、盐酸吡哆醇0.5～0.7mg/L、烟酸0.5～0.7mg/L、肌醇100～120mg/L、蔗糖1～10g/L、毒莠定9～10mg/L、脱落酸0.05～0.07mg/L、活性炭2000～3000mg/L、2‑吗啉乙磺酸300～400mg/L，pH＝5.6～6.2。6.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基为：以水为溶剂，含氯化铵535mg/L、硝酸钾2528mg/L、氯化钙440mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌1.72mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、谷氨酰胺1000mg/L、干酪素水解物500mg/L、精氨酸120mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.4mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖5000mg/L、毒莠定9.9mg/L、脱落酸0.053mg/L、活