一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103875528103875528A(43)申请公布日2014.06.25(21)申请号201310747637.2(22)申请日2013.12.31(71)申请人广东省农业科学院环境园艺研究所地址510640广东省广州市天河区金颖东一街1号(72)发明人于波朱根发孙映波(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人倪小敏(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书4页说明书4页附图3页附图3页(54)发明名称一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法(57)摘要本发明公开了一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法。本发明首次在葱莲属植物上建立了胚性细胞悬浮培养系的建立方法，本发明的胚性愈伤组织诱导率最高可达45.2%；胚性细胞悬浮培养系增殖迅速，胚性细胞团鲜重每周最高可增殖2.9倍；胚性细胞团的植株再生率最高可达85.3%。CN103875528ACN1038752ACN103875528A权利要求书1/1页1.一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）诱导形成胚性愈伤组织；（b）建立胚性细胞悬浮培养系，获得直径大于0.7毫米的胚性细胞团；（c）利用步骤（b）获得的胚性细胞团再生植株，其中所述建立胚性细胞悬浮培养系包括如下步骤：（b1）破碎所述胚性愈伤组织获得直径不超过0.7毫米的胚性细胞团；（b2）将0.2~1.0克的胚性细胞团接种于20mL悬浮培养基中，在温度25~27℃，光照800~1000lux，90~110转/分钟震荡培养，其中所述悬浮培养基以MS培养基为基本培养基，每1升基本培养基中添加0.5~1.0毫克的噻苯隆、1.0~3.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0；（b3）6~8天继代一次，继代时将增殖的胚性细胞团破碎，将0.1~0.2克的胚性细胞团转移至新鲜的悬浮培养基的中，按相同条件继续培养，3~4周后，获得大量胚性细胞团。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b2）中所述每1升基本培养基中添加1.0毫克的噻苯隆、1.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b2）中所述胚性细胞团的接种量为0.2g/20mL。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）包括：（a1）取葱莲的幼嫩花梗，经表面消毒处理，将幼嫩花梗切成1~3厘米长的片段，接种于胚性诱导培养基中；（a2）在温度25~27℃的黑暗环境中培养12~16周，获得亮黄色的松散易碎的胚性愈伤组织。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（a1）所述的胚性诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，同时还含有0.5毫克/升的TDZ、1.0毫克/升的2,4-D、20~40克/升的蔗糖和8克琼脂，pH值为5.6~6.0。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（c）包括：（c1）将获得的直径大于0.7毫米的细胞团接种至分化培养基中；（c2）在温度25~27℃、光照强度为1000~1400lux，每日10~14小时光照环境中培养8~10周后，经体细胞胚发生途径再生获得小植株。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（c1）所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，每1升基本培养基添加0.1~1.0毫克的ABA和20~40克的蔗糖，pH值为5.6~6.0。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述每1升基本培养基添加0.5毫克的ABA。2CN103875528A说明书1/4页一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法技术领域[0001]本发明涉及植物诱导再生技术领域，具体涉及一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法。背景技术[0002]葱莲（ZephyranthescandidaHerb.）又名葱兰、玉帘、白花菖蒲莲，为石蒜科葱莲属重要多年生的球根花卉，亦可药用，原产美洲。葱莲具有耐贫瘠、易成活，花朵繁多，花期长，被广泛用于城市园林绿化中，如花坛、花境、路边或林下、坡地等处作为地被植物。[0003]葱莲属植物的组织培养研究始于20世纪70年代，Furmanova和Oledzka（1976；1981）较早地报道了由葱莲属Z.robusta的离体鳞片诱导获得再生小植株。陈扬春（1992）以Z.candida的带鳞茎盘的鳞片诱导获得小鳞茎。Intakarn等（1997）使用Z.rosea的鳞茎基盘诱导出不定芽。Gayathri和Gopal（2007）诱导葱莲属植物的鳞茎基盘获得不定芽。Gangopadhyay等（2010）利用