农杆菌介导获得转基因抗虫匍匐翦股颖植株.pdf

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005，13(2)：262-263

·研究简报·

农杆菌介导获得转基因抗虫匍匐翦股颖植株：．c

胡繁荣
(金华职业技术学院生物工程学院，金华321007)

关键词：匍匐翦股颖；根癌农杆菌；转基因

ObtainingInsect—resistantTransgenicPlantsofCreepingBentgrass
(AgrostisstoloniferaL．)MediatedbyAgrobacteriumtumefaciens

HUFan-Rong

(BioengineeringSchool,JiohuaCollegeofProfession&Technology,Jinhua32100ZChina)

K哆期d．：creepingbentgrass；Agrobacteriumtumefaciens；transgenic

利用转基因技术，将目的基因导入愈伤组织或原生质周继代1次，经过4次继代培养后，将获得的抗性愈伤转入
体，获得转基因植株提高抗逆性，已成为匍匐翦股颖遗传改含1．5mg／L6-BA+1．5mg／LNAA+250mg／LCarb+100mg／L
良的重要手段(郭振飞和卢少云，2002)。本实验利用农杆菌介Hyg的MS选择分化培养基中进行植株再生。当分化的幼苗
导法，将经过改良的抗虫Bt基因crylAb导入匍匐翦股颖，长至3～5cm时转入I／2MS+0．3mg／LNAA+250mg／LCarb
初步建立了匍匐翦股颖遗传转化体系。+100mg／LHyg的培养基进行生根培养，1～2周后打开瓶盖
炼苗，1周后移栽至土壤中。
1材料和方法

1．1实验材料

以匍匐翦股颖(AgrosfisstoloniferaL．)为材料，根癌农杆H8EH8
菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105由加拿大渥太
图1．用于匍匐翦股颖转化的根癌农杆菌中pKSB双元载体
华大学生化系提供。杀虫晶体蛋白基因crylAb由玉米启动
T．DNA区结构
子Ubiquitin驱动，构建了卡那霉素抗性基因nptlI(由胭脂碱
Fig．i．T—DNAregionofpKUBbinaryvectorinAgrobacterium

合成酶启动子驱动)、潮霉素抗性基因hpt和报告基因gus(由tumefaciensusedfortransformation
CaMV35S启动子驱动1。PKUB双元载体T-DNA区结构与Pnos，胭脂碱合成酶启动子；Pubi,ubiquifin启动子；P35S,CaMV35S启动子；
crylAb基因编码区部分限制酶酶切位点如图1。nptII，新酶素磷酸转移酶基因；bpg潮霉素磷酸转移酶基因；LB，左边界；RB。
右边界；H，HindⅢ；B，BamHI；E，EcoRI。
1．2转化处理与选择培养f』：!《{
Pnos，nopaline{pro{moter；Pu《ubiquitinpromo~r；P35s,CaMV35Spromo~r；

将匍匐翦股颖成熟种子用1％升汞消毒处理后接入愈伤nptll，ncomvcinphosphotransferasegene；hp‘hygromy~inbphosphotransferase
诱导培养基(含2，4一D1mg／L和NAA3mg／L)，40~50d超过gene；LB，leftboundary；RB，rigtboundary；H，HhadUl；B．BamHI；E：EcoRI．
60％的种子诱导出无色或淡黄色的愈伤组织。将经过共培养
的愈伤组织用含500mg门L羧苄青霉素(Carb)的无菌水清洗1．3GUS活性检测
2～3次，用无菌滤纸吸去多余水分，置于附加2megL2，4-D按Rueb和Hensgens(1989)方法对再生的植株剪取少量
+250mg／LCarb+25mg／L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基上叶片进行组织化学染色，并取部分GUS染色为蓝色的植株
进行低压筛选培养1周，而后转置于含2mg／L2，4．D+250进行分子检测。
mg／LCarb+100mg／LHyg的MS正常选择压选择培养。每21．4抗性植株的分子检测

·基金项目：国家自然基金资助项目(『0．30370147)资助。
胡繁荣：男，1965生，硕士，副教授。E-mail：<[e-mail]>
收稿日期：2004．09．2O接受日期：2004-11-29

第2期胡繁荣：农杆菌介导获得转基因抗虫匍匐嘲股颖植株263

PcR检测：选部分GUS染色呈阳性的再生苗，按CTAB23Southemblot分析
法提取抗性植株的总DNA。PCR反应体系为25