一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌的引物、探针和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896322A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202210812577.7(22)申请日2022.07.11(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市卫岗1号(72)发明人张海峰奚佳诚杨静张正光郑小波杨志香(74)专利代理机构北京知文通达知识产权代理事务所(普通合伙)16051专利代理师刘江良(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌的引物、探针和试剂盒(57)摘要本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌的引物、探针和试剂盒，该引物对包含如SEQIDNO.1所示正向引物F‑primer和如SEQIDNO.2所示的反向引物R‑primer；该探针Probe的序列如SEQIDNO.3所示。与传统的依据形态特征和采用普通PCR来鉴定稻曲病菌的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为稻曲病菌的检测提供了新的技术平台，可用于稻曲病菌引起的稻曲病的高灵敏度快速检测。CN115896322ACN115896322A权利要求书1/1页1.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌引起的稻曲病的引物对和探针组合，其特征在于，该引物对包含：如SEQIDNO.1所示正向引物F‑primer和如SEQIDNO.2所示的反向引物R‑primer；该探针Probe的序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的引物对和探针组合在检测稻曲病菌引起的稻曲病中的应用。3.权利要求1所述的引物对和探针组合在制备用于检测稻曲病菌引起的稻曲病的试剂盒中的应用。4.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌引起的稻曲病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的引物对和探针组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包含有重组酶聚合酶扩增技术中常用的试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中各试剂的体积为：40.9μLABuffer，2μL10μmol·L‑1正向引物和反向引物，0.6μL10μmol·L‑1探针，2μLDNA模板，2.5μLBBuffer。7.权利要求1所述的引物对和探针组合或权利要求4至6任一项所述的试剂盒在检测稻曲病菌引起的稻曲病中的应用。8.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌引起的稻曲病的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，以待检微生物的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针组合进行重组酶聚合酶扩增，检测扩增产物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：通过琼脂糖凝胶电泳、或通过胶体金侧流层析试纸条检测反应产物；其中对于通过胶体金侧流层析试纸条检测，如果质控线和检测线都显色，则样品为阳性，而只有质控线显色，检测线不显色的样品为阴性。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：重组酶聚合酶扩增的反应程序为：40℃反应扩增20min。2CN115896322A说明书1/4页一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌的引物、探针和试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测稻曲病菌的引物、探针和试剂盒。背景技术[0002]稻曲病是水稻生产上的一种重要真菌病害，其病原菌为稻曲病菌。该病原菌主要侵染孕穗期水稻的穗部，而后菌丝在花器官内部定殖，吸取水稻穗部养分，最终转化为覆盖有暗绿色粉状厚垣孢子的稻曲球。稻曲球的形成不仅阻碍水稻籽粒的灌浆，而且影响其他小穗的不育性，从而造成严重的产量损失。此外，稻曲球产生有毒的真菌毒素，威胁人类和动物的健康。目前对稻曲病还没有比较有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病害的有效措施之一。为此应建立快速检测方法，为田间稻曲病菌的检测及稻曲病的预测预报提供技术支撑，从而减少稻曲病造成的损失。[0003]目前，针对稻曲病菌引起的稻曲病的检测技术较少。传统的检测方法主要是依据稻曲病菌的形态进行鉴定。由于稻曲病菌分离困难且培养周期较长，给检测带来了巨大不便。随着分子生物学的发展，特别是PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到稻曲病菌的检测中，包括PCR技术和LAMP技术等。虽然这些技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足田间快速检测的需求。[0004]重组酶聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）