一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927652A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210977336.8(22)申请日2022.08.15(71)申请人河南农业大学地址450002河南省郑州市金水区农业路63号(72)发明人王珂李宇李洪连赵湘媛袁虹霞孙炳剑李永辉(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465专利代理师孙光远(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表2页附图1页(54)发明名称一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，涉及生物技术领域。本发明通过比对桑尼短体线虫的不同基因区段进行引物的设计筛选，获得特异性RPA引物，利用BasicRPA试剂盒进行反应，反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。若电泳结果出现277bp的特异性条带，则待测线虫为桑尼短体线虫，反之则无，可以高效、快速、便捷、准确的获得检测结果，为早期田间预测预报和防控提供技术支持，同时操作简单，不依赖昂贵的精密仪器和专业技术背景，为基层人员使用提供了便利。CN115927652ACN115927652A权利要求书1/1页1.一种用于检测桑尼短体线虫的RPA引物，其特征在于：所述RPA引物的核苷酸序列如下：正向引物‑Pt‑RPAF1：5′‑TGAAAACGAAAAATTCTAGCCTTATCGGTG‑3′，如SEQIDNO.1；反向引物‑Pt‑RPAR1：5′‑TTCATATGTTTGTATGCGAATTCAACTGAT‑3′，如SEQIDNO.2。2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组分包括：再水化缓冲液，无酶水，醋酸镁，RPA冻干酶粉。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，反应体系如下：再水化缓冲液29.5μL，无酶水11.2μL，醋酸镁2.5μL，10μM的上游引物和下游引物各2.4μL，DNA模板2μL，RPA冻干酶粉5mg。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，反应条件如下：金属浴40℃中20分钟，随后在冰上结束反应。6.权利要求1所述的引物在制备检测桑尼短体线虫试剂盒的应用。7.权利要求1所述的引物或权利要求2～5任一所述的试剂盒在检测桑尼短体线虫上的应用。8.基于权利要求5所述试剂盒快速检测桑尼短体线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的DNA；(2)以步骤(1)所提取的DNA作为RPA反应的模板，采用引物，进行RPA反应扩增，获得RPA反应产物；(3)对步骤(2)获得的RPA反应产物进行纯化，用琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述分析的标准：若在277bp处出现扩增条带则为桑尼短体线虫。2CN115927652A说明书1/4页一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]短体线虫(Pratylenchusspp.)对全球作物的危害程度仅次于根结线虫(Meloidogyne)和孢囊线虫(Heterodera)，是世界上第三大植物病原线虫。短体线虫的寄主众多，地理分布广泛，在全世界范围内广泛发生危害。短体线虫属于迁徙性植物内寄生线虫，在整个生命周期中都存在迁移。短体线虫侵染寄生植物，一般采用口针穿刺取食根系表皮，造成机械损伤，严重时能造成植物根系的功能丧失及坏死腐烂。短体线虫侵染寄生植物所造成的机械损伤，为真菌、细菌等其它病原物的侵染提供了便利，从而造成复合侵染现象的发生，给农业造成更大损失。桑尼短体线虫(P.thornei)是危害最为严重的短体线虫之一，在我国发生普遍，严重危害多种粮食作物和经济作物。植物线虫体型微小，大多为土传病害，一般难以发现，且造成植物根系的受害症状与很多真菌病害难以区分。因此，桑尼短体线虫的快速准确检测，对于农业生产和检疫工作具有重要意义，对于作物抗病品种的选育和病害的防治也有重要的意义。[0003]传统的短体线虫鉴定多采用形态学鉴定，主要通过显微镜观察线虫的形态特征和形态结构的测量值。线虫形态学特征包括内部特征和外部特征。内部特征是线虫的生殖系统和消化系统等的结构特征；外部特征是线虫的体长、头部、尾部等的形态特征。形态学鉴定是线虫分类鉴定的基础，也是线虫分类鉴定的重要特征。但是由于不同的人之间操作的不同，经常导致线虫的形态测量出现误差。形态学鉴定对于操作人员