一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115925996A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211386271.6A61K39/245(2006.01)(22)申请日2022.11.07A61K9/14(2006.01)A61P31/22(2006.01)(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号华中农业大学农业微生物国家重点实验室B座(72)发明人钱平任旭皎李祥敏(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师薛红凡(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/866(2006.01)C12N9/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用(57)摘要本发明提供了一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒及其制备的疫苗和制备方法以及应用，属于生物制品技术领域。本发明提供的猪伪狂犬病纳米颗粒LSgD免疫小鼠后能够产生很强的针对PRV的特异性抗体与中和抗体。利用本发明所述方法制备的PRVgD抗原可以与纳米颗粒载体LS在体外自装成六十聚体的纳米颗粒，制备的疫苗能够激起机体产生强烈的体液免疫与细胞免疫反应，并对小鼠产生很好的保护效果，可作为一种非常有前景的候选基因工程疫苗来预防猪伪狂犬病。CN115925996ACN115925996A权利要求书1/2页1.一种猪伪狂犬病自组装纳米颗粒，其特征在于，是重组蛋白SCLS和STgD自组装得到；所述重组蛋白SCLS的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；重组蛋白STgD的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。2.根据权利要求1所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒，其特征在于，所述重组蛋白STgD的N端包含蜂毒素信号肽，C端含有8×His标签；所述蜂毒素信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述8×His标签的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。3.一种权利要求1或2所述猪伪狂犬病自组装纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码重组蛋白SCLS的核苷酸序列插入载体中经原核表达系统表达，得到重组蛋白SCLS；将含酶位点、肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列以双拷贝的形式插入杆状病毒转移载体中，得到含双拷贝的STgD的重组杆状病毒转移载体；将所述含双拷贝的STgD的重组杆状病毒转移载体转化至DH10Bac感受态细胞中，经筛选得到重组杆状病毒穿梭载体；将所述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid‑2×STgD转染昆虫细胞，拯救得到重组杆状病毒；将所述重组杆状病毒经重组表达和纯化，得到重组蛋白STgD；将所述重组蛋白SCLS和重组蛋白STgD经体外自组装得到，猪伪狂犬病自组装纳米颗粒。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述编码重组蛋白SCLS的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，将编码重组蛋白SCLS的核苷酸序列插入载体中经原核表达系统表达和纯化的方法为将编码重组蛋白SCLS的核苷酸序列先插入pUC57载体中，经过限制性内切酶NcoI和XhoI酶切处理，回收SCLS基因再插入相同酶切处理的原核表达质粒pET‑28a(+)中，得到的重组质粒pET‑28a(+)‑SCLS转化至BL21(ED3)大肠杆菌感受态中，经IPTG诱导表达，镍柱纯化，得到重组蛋白SCLS。6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述含酶位点、肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列包括含BamHI/EcoRI酶位点、肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列和含SpeI/HindIII酶位点、SpyTag003肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列；所述含BamHI/EcoRI酶位点、SpyTag003肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列采用引物对STgD‑1F/STgD‑1R扩增得到；所述STgD‑1F的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述STgD‑1R的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述含SpeI/HindIII酶位点、SpyTag003肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列采用引物对STgD‑2F/STgD‑2R扩增得到；所述STgD‑2F的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；所述STgD‑2R的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述将含酶位点、肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列以双拷贝的形式插入杆状病毒转移载体中的方法，包括将含BamHI/EcoRI酶位点、SpyTag003肽标签的PRVgD蛋白的核苷酸序列和含SpeI/HindIII酶位点、SpyTag00