一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2克隆转化的方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948432A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211015966.3(22)申请日2022.08.23(71)申请人山东农业大学地址271000山东省泰安市岱宗大街61号(72)发明人孔令让周婷婷马信李文欣赵微侯冰倩(74)专利代理机构北京中知慧专利代理事务所(普通合伙)11969专利代理师卜爱华(51)Int.Cl.C12N15/54(2006.01)C12N9/10(2006.01)C12N15/84(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)权利要求书1页说明书8页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2克隆转化的方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2克隆转化的方法及其应用。在对小麦‑长穗偃麦草(7D/7el2)易位系的材料表型分析发现，易位系材料小麦精面粉色泽为黄色，通过对长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum)全基因组测序，酵母文库筛选，发现长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶PSY‑E2基因可能参与调控小麦胚乳叶黄素的形成。根据长穗偃麦草基因组设计特异性引物，最终克隆得到PSY‑E2基因。通过转基因技术将长穗偃麦草PSY‑E2基因转入普通小麦品种Fielder中，发现转入PSY‑E2后的转基因小麦面粉显著变黄，叶黄素含量显著上升。CN115948432ACN115948432A权利要求书1/1页1.一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2克隆转化的方法，包括以下步骤：(1)材料选择；小麦‑长穗偃麦草7D/7el2易位系，该易位系中所有单株的精面粉色泽均为黄色，即胚乳发黄；(2)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2基因启动子序列的克隆；以小麦‑长穗偃麦草7D/7el2易位系A052‑2的DNA为模板，利用正反向引物进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY‑E2基因启动子序列，如SEQIDNo.1所示，包含3002bp核苷酸；(3)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2基因CDS序列的克隆；以小麦‑长穗偃麦草7D/7el2易位系A052‑2的cDNA为模板，利用正反向引物进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY‑E2基因CDS序列，如SEQIDNo.2所示，包含1293bp核苷酸；(4)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2基因原始表达载体构建；以测序正确的启动子和CDS序列作为模板，分别利用3301‑E2prom‑F/E2prom‑R和E2prom‑CDS‑F/3301‑E2‑R两对引物，进行PCR扩增，胶回收产物通过同源重组到pCAMBIA3301载体，热激转化大肠杆菌DH5a，并测序验证；测序正确阳性克隆pCAMBIA‑PSY‑E2热激转化农杆菌EHA105，PCR检测为阳性的克隆进行保存，用于进一步的遗传转化；(5)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2基因转化以及小麦胚乳叶黄素合成中的检测，包括：小麦遗传转化，转基因阳性株系检测，转基因小麦总类胡萝卜素含量检测，转基因小麦叶黄素含量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述正反向引物为PSY‑E2启动子克隆引物序列如下：PSY‑E2‑prom‑F：CATGATGCCACTAACTCTGA；如SEQIDNo.3所示；PSY‑E2‑prom‑R：AGCAGTGCAGGCTCACGTGGT；如SEQIDNo.4所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述正反向引物为PSY‑E2的cDNA克隆引物序列如下：PSY‑E2：GTGCCTCAATTCCTCTGCTCC；如SEQIDNo.5所示；PSY‑E2‑R：GCCTAACCTGACCATCTTCATCTTG；如SEQIDNo.6所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述引物3301‑E2prom‑F/E2prom‑R和E2prom‑CDS‑F/3301‑E2‑R分别如下：3301‑E2prom‑F：agctatgaccatgattacgaattcCATGATGCCACTAACTCTGA；如SEQIDNo.9所示；E2prom‑R：GTGCTGCATGCGCGCAACAC；如SEQIDNo.10所示；E2prom‑CDS‑F：gtgttgcgcgcatgcagcacATGGCCACCACCGCCACGC；如SEQIDNo.11所示；3301‑E2‑R：gatccccgggtaccgagctcGAATTCGGTCTGGTTATTTCTCAGT；如SEQIDNo.12所示。5.长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因