一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组PRRSV和ASFV的抗体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116003617A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211454838.9(22)申请日2022.11.21(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人高飞童光志童武李丽薇李国新周艳君姜一峰郑浩虞凌雪刘长龙(74)专利代理机构北京市诚辉律师事务所11430专利代理师范盈(51)Int.Cl.C07K16/46(2006.01)G01N33/569(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组PRRSV和ASFV的抗体及其应用(57)摘要本发明提供一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗株和野生毒株的抗体及其应用，可以区分嵌合疫苗rPRRSV‑p54、野生型的非洲猪瘟和PRRSV，所述纳米抗体具有较强的抗原特异性，仅与表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV‑p54发生抗原抗体反应，与亲本病毒并没有相应的亲和反应。可以有效的区分疫苗株和野生型，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。CN116003617ACN116003617A权利要求书1/1页1.一种可以区分嵌合疫苗rPRRSV‑p54、野生型的非洲猪瘟和野生型的PRRSV的纳米抗体，其特征在于所述抗体为纳米抗体AP54‑27，所述纳米抗体AP54‑27的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种非疾病的治疗和诊断方法的，有效的区分嵌合疫苗rPRRSV‑p54的方法，所述方法为利用权利要求1所述的纳米抗体进行检测。3.一种胶体金试剂条，所述胶体金试剂条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，所述NC膜上设置有相互分离的结合垫区、检测区和质控区，所述结合垫区喷涂胶体金标记的权利要求1所述的纳米抗体AP54‑27，所述检测区喷涂针对抗原的混合抗体，所述质控区喷涂有与胶体金标记的权利要求1所述的纳米抗体AP54‑27特异结合的抗体。4.如权利要求3所述的胶体金试剂条的应用，所述应用为非疾病的治疗和诊断的区分rPRRSV‑p54、亲本猪瘟病毒、PRRSVHuN4‑F112株。2CN116003617A说明书1/6页一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组PRRSV和ASFV的抗体及其应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组PRRSV和ASFV的抗体及其应用。背景技术[0002]ASFV是感染家猪或者野猪引起的一种急性、烈性、出血性，高度接触性传染病。其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％。严重威胁全球养猪业。目前尚没有有效的疫苗和治疗方法。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20％‑50％，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞中复制，其基因组约170‑193kb，含有150‑167个ORF，编码150‑200种蛋白质。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核(Nucleoid)、核壳(Coreshell)、内囊膜(Innerenvelope)、衣壳(Capsid)和外囊膜(Externalenvelope)。[0003]ASFV的p54蛋白的编码基因为E183L，共555nt，其蛋白分子量约为19.9kD。p54蛋白是ASFV表达的早期膜蛋白，含跨膜结构域，定位于内质网衍生的内膜前体，在病毒吸附易感细胞和入侵过程中发挥着重要作用。研究发现，ASFV结构蛋白p54过表达可以促进细胞凋亡。深入研究表明p54能与胞质动力蛋白轻链LC8特异性相互作用，实现病毒在胞质内的转运。p54是一种重要的结构蛋白，p54的缺失，将使病毒结构不稳定，有研究表明p54具有免疫原性，是病毒的主要的免疫原蛋白。能够刺激机体产生针对该蛋白的抗体，可能是理想的ASFV亚单位疫苗的抗原蛋白。[0004]本实验室前期研究成果旨在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4‑F112的全长感染性克隆骨架上，插入ASFV的p54的编码基因E183L的核苷酸序列，获得能够稳定表达ASFVp54蛋白的重组PRRS病毒。已经成功开发出一种表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pA‑ASFV‑p54，使用重组质粒pA‑ASFV‑p54，转染MARC‑145