赤藓糖醇生产菌的选育方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102911889A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102911889A(43)申请公布日2013.02.06(21)申请号201210463413.4(22)申请日2012.11.17(71)申请人山东福田药业有限公司地址251200山东省德州市禹城市南环路666号(72)发明人王星云邱学良李雨王成福秦海青李毅(74)专利代理机构德州市天科专利商标事务所37210代理人房成星(51)Int.Cl.C12N1/19(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书22页页(54)发明名称赤藓糖醇生产菌的选育方法(57)摘要一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，属于微生物技术领域。该方法采用基因工程的手段对菌种进行改造以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowialipolytica菌株进行选育，从而获得了Yarrowialipolytica赤藓糖醇高产菌株。其具体选育方法步骤包括：（1）基因工程改造、（2）培养基制备、（3）培养条件优化，获得高产赤藓糖醇生产菌菌种。本发明通过基因工程改造，避免了传统工艺的盲目性，同时减轻了后续大量的筛选检测工作，Yarrowialipolytica中4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产。大大提高了赤藓糖醇生产菌的选育效率、菌种活力及产量。CN10298ACN102911889A权利要求书1/1页1.一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，其特征是首先采用基因工程的手段对菌种进行改造，以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowialipolytica菌株进行选育，从而获得了Yarrowialipolytica赤藓糖醇高产菌株；其具体选育方法步骤如下：（1）基因工程改造：4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶是赤藓糖醇生产的关键因子；通过低温超声破碎、凝胶色谱分离技术及全波长分光光度计，分离得到这两种酶，分析获得了这两种酶的基因结构；然后用PCR扩增仪将获得的这两种酶的基因片段进行大量复制，PCR扩增的条件：90℃变性30S、53℃退20S，72℃延伸30S；然后将得到的基因分别连接到pBR327质粒中；将质粒转化到Yarrowialipolytica中，使其在细胞内大量拷贝；这样Yarrowialipolytica中4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产；将转化成功的Yarrowialipolytica进一步富集培养，制成试管斜面在4℃冰箱中保存待用；（2）培养基制备：优化得到的培养基配比按重量计分别为：一水葡萄糖30%-40%，柠檬酸铵1%-2%，七水硫酸镁0.01%-0.08%，氯化铜0.0003%-0.0006%，110℃，灭菌20min；（3）培养条件优化：由于培养条件对于微生物的代谢有很大的影响，所以必须对Yarrowialipolytica的培养条件从温度、通风两个方面进行了重复试验与优化；温度在28℃-31℃时其他副产物最少；每分钟的通风量为料液体积的20%-50%时，Yarrowialipolytica细胞到达稳定期的时间比较短，最终获得的高产菌，最终获得的高产菌，并利于赤藓糖醇的生产。2CN102911889A说明书1/2页赤藓糖醇生产菌的选育方法技术领域[0001]本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种赤藓糖醇生产菌的选育方法。背景技术[0002]Yarrowialipolytica,中文名被翻译为解脂耶罗威亚酵母、解脂耶氏酵母、解脂耶罗维亚酵母。赤藓糖醇工业化生产是近几年才兴起的，全球的实际产量约6万吨/年左右。由于赤藓糖醇是零热量的天然甜味剂，随着人们健康理念的增强，在市场上越来越受到人们的青睐。继而科研院所、高校等科研工作者对于赤藓糖醇生产技术，特别是菌种的研究越来越多。[0003]目前，赤藓糖醇生产菌的选育方法主要采用化学诱变、物理诱变的方法，由于现有的选育方法存在诱变方向难以把握，诱变后还有大量的培养检测筛选工作要做、存在选育程序复杂，获得优异菌种的时间很长、几率较低等缺陷，致使赤藓糖醇生产菌的选育程序复杂，选育效率低，菌种活力差、产量低，菌种专一性差、转化率低。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，以解决现有技术赤藓糖醇生产菌的选育程序复杂，选育效率低、菌种活力差、菌种专一性差、产量低、转化率低等问题。[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案：首先采用基因工程的手段对菌种进行改