利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105713979A(43)申请公布日2016.06.29(21)申请号201610212419.2(22)申请日2016.04.07(71)申请人中国农业科学院棉花研究所地址455004河南省安阳市开发区黄河大道38号(72)发明人张利娟崔金杰雒珺瑜张帅王春义吕丽敏朱香镇王丽李春花(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表2页附图11页(54)发明名称利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法(57)摘要本发明提供利用线粒体分子标记快速鉴定牧草盲蝽(Lyguspratensis)种群的方法，特别是对新疆种群以及甘肃、宁夏种群进行鉴别。本发明根据牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II(COII)、细胞色素b(Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5(ND5)、16SrDNA四个基因片段分别设计特异性引物，然后将PCR扩增产物进行串联比对，从而实现对我国牧草盲蝽种群的鉴定。该方法简单可靠，可操作性强，稳定性好，可重复性强。CN105713979ACN105713979A权利要求书1/1页1.用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物对①～④中的至少两种：①PCR扩增牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II基因的引物对，②扩增细胞色素b基因的引物对，③扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因的引物对；④扩增16SrDNA的引物对；引物序列如下：①L-COII-F：5'–TGGCAGAATAAGTGCCATGA–3'L-COII-R：5'–GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC–3'②L-ND5-F：5'–AAACATAATTACCTGAACCCATGAA–3'L-ND5-R：5'–TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG–3'③L-Cytb-F：5'–TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG–3'L-Cytb-R：5'–CCGTGCTCCAATTCATGTTA–3'④L-16S-F：5'–TCCACAAATATCCCCAATCTG–3'L-16S-R：5'–CCTTGAAATGTCCCTTCTCG–3'。2.根据权利要求1所述的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物对①～④。3.含有权利要求1或2所述引物组合的用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。5.利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测牧草盲蝽的基因组DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1或2所述引物对①～④分别进行PCR扩增反应；3)纯化并分析PCR产物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：5×PCR反应缓冲液5μL，10mMdNTPs0.5μL，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μL，10μM上、下游引物各1μL，模板DNA2μL，无菌水补足至25μL。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照COII-ND5-Cytb-16SrDNA串联拼接，串联序列大小为3190bp，新疆种群第300、543、1204、1279、1981、2509、2999、3161bp处碱基依次为A、A、T、G、A、A、A、C，甘肃宁夏种群依次为G、G、C、A、G、G、G、T。2CN105713979A说明书1/4页利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法。背景技术[0002]牧草盲蝽(Lyguspratensis)属于盲蝽科(Miridae)草盲蝽属(Lygus)，为棉田重要的害虫种类之一，尤其是近十年来，随着转基因棉花的大量种植，伴随着化学农药的减少使用，该虫已经从次要害虫上升为主要害虫，特别是我国的西北棉区呈急剧上升趋势。牧草盲蝽种群数量大范围内的明显增加和空间范围的扩张给防治工作带来很大挑战。[0003]大量的研究表明牧草盲蝽虽然在中国西北地区种群数量大且危害严重，但该昆虫的外部形态特征在不同地理种群间差异并不明显，很难进行区分，因此通过外部形态特