苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106048063A(43)申请公布日2016.10.26(21)申请号201610662094.8(22)申请日2016.08.12(71)申请人安阳工学院地址455000河南省安阳市黄河大道(72)发明人王景顺李晓珍侯相全张花伟邢盛伟徐会王青秀尚玲飞栗如峰王英霞李现社(74)专利代理机构北京旭路知识产权代理有限公司11567代理人要然(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书3页说明书7页附图3页(54)发明名称苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法(57)摘要本发明提供了一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法，该方法具有操作简单、快速、准确、灵敏等优点。该方法包括：步骤A：提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA，进行浓度及OD值检测，并稀释备用；步骤B：设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物；步骤C：使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增；步骤D：对PCR分子反应体系进行优化；步骤E：采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；步骤F：根据扩增产物的片段大小及目的条带显现程度确定其准确性及扩增效果的稳定性。CN106048063ACN106048063A权利要求书1/3页1.一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法，其特征在于，包括：步骤A：提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA，进行浓度及OD值检测，并稀释备用；步骤B：设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物，其中苜蓿盲蝽与三点苜蓿盲蝽线粒体与核糖体分子标记及其对应的9对特异引物序列和1对通用引物序列如下所示：苜蓿盲蝽线粒体分子标记：COI标记：如SEQIDNO:1所示；COI标记的特异性引物序列：Lin-COI-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATCLin-COI-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGACYTB标记：如SEQIDNO:2所示；CYTB标记的特异性引物序列：Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACACLin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAAND5标记：如SEQIDNO:3所示；ND5标记的特异性引物序列：Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAALin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT苜蓿盲蝽核糖体分子标记：16SrDNA标记：如SEQIDNO:4所示；16SrDNA标记的特异性引物序列：Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATTLin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATTEF-1a标记：如SEQIDNO:5所示；Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTGLin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC三点苜蓿盲蝽线粒体分子标记：COI标记：如SEQIDNO:6所示；COI标记的特异性引物序列：Fas-COI-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATFas-COI-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCACYTB标记：如SEQIDNO:7所示；CYTB标记的特异性引物序列：Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAACFas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAAND5标记：如SEQIDNO:8所示；ND5标记的特异性引物序列：Fas-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAAA2CN106048063A权利要求书2/3页Fas-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT16SrDNA标记：如SEQIDNO:9所示；16SrDNA标记的特异性引物序列：Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATTFas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAGrDNA-ITS标记：如SEQIDNO:10所示；rDNA-ITS标记的通用引物序列：28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTCP1：ATCACTCGGCTCGTGGATCG步骤C：使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增；步骤D：对PCR分子反应体系进行优化；步骤E：采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；