利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105779627A(43)申请公布日2016.07.20(21)申请号201610296879.8(22)申请日2016.05.06(71)申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市石桥路198号(72)发明人曹联飞(74)专利代理机构杭州九洲专利事务所有限公司33101代理人陈继亮(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页(54)发明名称利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法(57)摘要本发明涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，该方法步骤如下：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱-20℃保存备用。(2)蜜蜂基因组DNA提取：取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA，进行DNA浓度和纯度测定。(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物为：F：5’-TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积。本发明的有益效果为：利用线粒体DNA分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定，操作简单，稳定性好。CN105779627ACN105779627A权利要求书1/1页1.一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱-20℃保存备用；(2)蜜蜂基因组DNA提取：剪取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，使用酚仿抽提法提取DNA；(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物为：F：5’-TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’；PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，42℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃后延伸10min；将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后进行测序；(4)鉴定浙江浆蜂蜂群：将步骤(3)的测序结果使用DNAStar软件进行序列查看和校正，根据等位基因鉴定浙江浆蜂蜂群，当等位基因为A时，此蜂群为浙江浆蜂。2.根据权利要求1所述的利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，其特征在于：待鉴定蜂群为纯种蜂群，如果是杂交蜂群，该方法只能鉴定其母亲是否来源于浙江浆蜂。2CN105779627A说明书1/4页利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法技术领域[0001]本发明属于畜牧品种鉴定技术领域，具体涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法。背景技术[0002]我国是世界第一养蜂大国，更是世界蜂王浆的主要生产国和出口国，蜂王浆产量和出口量均占世界90％以上。中国蜂王浆产量居世界首位很大程度上归功于20世纪80年代我国培育成功的王浆高产蜂种—浙江浆蜂。浙江浆蜂已被列入国家畜禽遗传资源目录。目前浙江浆蜂已推广至除西藏外的全国各地，在我国蜂种市场占有重要地位，在我国蜂王浆生产中发挥着重要作用。[0003]目前蜂种鉴定的主要方法还是形态学测定，费时费力，误差较大，尤其是亲缘关系相近的蜂种很难从形态上快速鉴别。目前还没有用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效方法，严重影响了浙江浆蜂种蜂业的健康发展，迫切需要用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效的技术手段。[0004]线粒体DNA是动物细胞核外唯一的遗传物质，具有结构简单、进化速度快、母系遗传和基因重组率小等特点。此外，由于蜜蜂特殊的生殖机制，一个蜂群中所有的工蜂都拥有与蜂王相同的线粒体DNA，一只工蜂就可代表蜂王和整个蜂群，这就大大减少了工作量，使其成为研究蜜蜂分类和品种鉴定的一种重要的遗传标记。NADH脱氢酶第二亚基(NADHdehydrogenasesubunit2，ND2)是线粒体电子传递链复合体的组分之一。很多研究表明,与线粒体其他蛋白质编码基因和rRNA基因相比，ND2基因具有更快的进化速率。许多学者已经将ND2基因序列应用于动物分类研究并显示出其良好的分子标记特性。因此，申请人开展了蜂线粒体ND2基因序列的克隆、多态位点筛查及