包含具有大范围核酸酶活性的序列的组合物和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CN104411823A(43)申请公布日(43)申请公布日2015.03.11(21)申请号201380035464.X(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2013.05.01司72001代理人邹雪梅李炳爱(30)优先权数据(51)Int.Cl.61/642，4702012.05.04US61/683，7652012.08.16USC12N9/22(2006.01)C12N15/82(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2014.12.31(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0390112013.05.01(87)PCT国际申请的公布数据WO2013/166113EN2013.11.07(71)申请人纳幕尔杜邦公司地址美国特拉华州威尔明顿申请人先锋国际良种公司(72)发明人E.伯穆德兹A.M.西甘J.恩格里斯S.C.发科H.高L.刘Z-B.刘A.安格S.斯维塔舍夫J.K.杨权利要求书20页说明书93页序列表401页附图25页(54)发明名称包含具有大范围核酸酶活性的序列的组合物和方法(57)摘要本发明提供了包含具有大范围核酸酶活性的多核苷酸和多肽的组合物和方法。另外提供了具有大范围核酸酶序列的核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。提供了使用所述大范围核酸酶序列的各种方法。此类方法包括用于制备在宽泛的温度范围具有提高的活性的大范围核酸酶的方法、用于制备包含具有提高的活性的大范围核酸酶的酵母、植物、植物细胞、外植体或种子的方法。CN104411823ACN104411823A权利要求书1/20页1.一种分离的或重组的多核苷酸，其包含编码大范围核酸酶多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：a)在对应于SEQIDNO：1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQIDNO：1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；或b)具有(a)的任何氨基酸修饰中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与SEQIDNO：1具有至少80％的序列同一性的大范围核酸酶多肽。3.根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰包括：a)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸(D)；b)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸(H)；c)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸(I)；d)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸(C)；e)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸(L)；f)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸(R)；g)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺(N)；h)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸(L)；i)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸(R)或赖氨酸(K)；j)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸(L)；k)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸(I)；l)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸(H)或丙氨酸(A)；m)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸(V)；n)在对应于SEQIDNO：1中氨基酸位置71的位置处的赖