用于快速诊断疟疾的引物组以及含有该引物组的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104561318A(43)申请公布日2015.04.29(21)申请号201510011908.7C12R1/90(2006.01)(22)申请日2015.01.12(71)申请人天津朗力医药科技有限公司地址300457天津市滨海新区轻纺经济区纺四路1号236室(72)发明人李佩佩赵振军邢骅范琦杨照青崔立旺张耀洲(74)专利代理机构宁波市鄞州甬致专利代理事务所(普通合伙)33228代理人李迎春(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称用于快速诊断疟疾的引物组以及含有该引物组的试剂盒(57)摘要本发明提供一种用于快速诊断疟疾的引物组，以及含有该引物组的试剂盒、该引物组的使用方法。所述引物组包括第一引物组和第二引物组，第一引物组包括如SEQIDNO:1所示的外侧上游引物和如SEQIDNO:2所示的外侧下游引物，第二引物组包括内侧混合上游引物和内侧混合下游引物，其中内侧混合上游引物包含等比例的针对恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的四条F端引物，内侧混合下游引物包含等比例的针对恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的四条R端引物。该引物组通过改良PCR反应体系，增大了四种疟疾PCR目的产物的大小区别，直接杜绝了混淆的可能性，根据一次琼脂糖凝胶电泳结果就可以进行结果判定，判断直观、简便、快速。CN104561318ACN104561318A权利要求书1/1页1.一种用于快速诊断疟疾的引物组，其特征在于：包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组包括如SEQIDNO:1所示的外侧上游引物和如SEQIDNO:2所示的外侧下游引物，所述第二引物组包括内侧混合上游引物和内侧混合下游引物，其中内侧混合上游引物包含等比例的针对恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的四条F端引物，分别为如SEQIDNO:3所示的Inner-Pf-F、如SEQIDNO:4所示的Inner-Pv-F、如SEQIDNO:5所示的Inner-Pm-F和如SEQIDNO:6所示的Inner-Po-F，内侧混合下游引物包含等比例的针对恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的四条R端引物，分别为如SEQIDNO:7所示的Inner-Pf-R、如SEQIDNO:8所示的Inner-Pv-R、如SEQIDNO:9所示的Inner-Pm-R和如SEQIDNO:10所示的Inner-Po-R。2.含有权利要求1所述的用于快速诊断疟疾的引物组的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+。3.根据权利要求2所述的含有权利要求1所述的用于快速诊断疟疾的引物组的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照、去离子水。4.权利要求1所述的用于快速诊断疟疾的引物组的使用方法，其特征在于包括以下步骤：(1)对待测样本进行处理，得到DNA模板；(2)第一步PCR：配制反应体系，每25～50μL反应体系中含2mmol/LMgCl2、四种脱氧核苷三磷酸各0.2mmol/L、外侧上游引物和外侧下游引物各75～150ng、Taq酶0.5～1.5U、DNA模板1～4μL或整个血片，其余为去离子水，进行PCR扩增；(3)第二步PCR：配制反应体系，每25～50μL反应体系中含2mmol/LMgCl2、四种脱氧核苷三磷酸各0.2mmol/L、内侧混合上游引物和内侧混合下游引物各300～600ng、Taq酶0.5～1.5U、第一步PCR产物1～4μL，其余为去离子水，进行PCR扩增；(4)取第一步PCR产物和第二步PCR产物各10～15μL，进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果判定待测样本是否为阳性。5.根据权利要求4所述的用于快速诊断疟疾的引物组的使用方法，其特征在于：所述待测样本为血液、唾液或尿液中的一种，所述血液包括滤纸血、液体血液。6.根据权利要求4所述的用于快速诊断疟疾的引物组的使用方法，其特征在于：当待测样本为滤纸血时：滤纸血标本取2mm×2mm大小的血片，加入离心管中，用50～500μL含有0.1～1.0％皂苷的磷酸盐缓冲液浸泡并震荡10min～24h，离心弃上清，再加入1mL磷酸盐缓冲液清洗血片，离心弃上清，血片直接做DNA模板。7.根据权利要求4所述的用于快速诊断疟疾的引物组的使用方法，其特征在于：当待测样本为液体血液、唾液或尿液中的一种时：采取酚氯仿抽提法或DNA提取试剂盒提取DNA并纯化后，得到DNA模板。8.根据权利要求4所述的用于快速诊断疟疾的引物组的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)第一步PCR的扩增条件为：94℃5min；以94℃1min，55℃1min，72℃2min条件循环35